如何快准狠设计PCR引物

做完RNAseq测序想要验证基因表达上调下调，还是购买烧钱抗体做Westernblot之前先验证一下关键基因的表达都离不来荧光定量PCR实验，这就需要又快又准的设计好RealtimePCR引物，今天小编就分享一下如何利用NCBI设计PCR引物。首先介绍一下荧光定量PCR引物设计原则：

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；

2、引物GC含量一般为40%-60%，45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之间。

4、引物3’端的碱基一般不用A。A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

6、尽量在Exonjunction上设计引物，限制基因组DNA扩增。

7、使用BLAST检索，确认引物特异性。