RTqPCR验证，选哪个lncRNA的

尹师妹要对手里那套lncRNA-seq获得的差异表达lncRNA做RT-qPCR验证，问题来了：

选哪个lncRNA呢？选变化倍数大的？表达量高的？

选lncRNA的哪段呢？5’端？外显子？跟其他基因有重叠怎么办？

尹师妹是个爱思考的好孩纸，比直接拿lncRNA全长cDNA序列找引物靠谱多了~~~

******************************************

RT-qPCR验证哪些要素是必须保证的？

第一，打算后面做RT-qPCR验证，那么送去做测序的RNA样品，一定要保留一部分，至少要冻在-80，最好存液氮，或者反转录后存cDNA。

等测序分析结果回来了，用跟测序同一批次的RNA样品做RT-qPCR~

RT-qPCR验证sequencing结果，是用一个技术平台验证另一个技术平台的结果，所以，除了所使用的技术平台不同以外，其他条件都要尽量相同，其中最重要的就是样品一定要相同。

如果用来做RT-qPCR的样品跟测序不是同一批次，那么你验证的就是两层面的叠加：技术平台间的差异+生物学重复间的差异。如果叠加的结果不一致，就搞不清楚是技术平台层面的问题，还是生物学重复的不一致。

第二，要做RT-qPCR的区段，不能与其他基因exon重叠，否则，RT-qPCR结果就混合了两个基因的表达量。

最好选择基因间的lncRNA，即lincRNA，跟其他基因没有重叠。

其次是位于其他基因intron区域的lncRNA。

为什么位置最重要呢？

这是RT-qPCR技术本身的限制决定的。

用Strand-specific技术建库的lncRNA-seq可以区分来自正义链和反义链的转录本，而普通的RT-qPCR不能区分来自不同链的RNA。

第三，PCR产物所在的区段峰较高，且在样品间要有明显的变化。

基因的某些区域可能看不到很多的read，这可能是以下原因导致的：1.PCR或测序偏好；2.基因有不同isoform，在你的样品里可能只表达其中一种isoform；3.基因结构注释有问题。

选择高峰所在的区段能保证万无一失。

第四，高表达量和变化倍数。

表达量高的基因比表达量低的基因，更容易做RT-qPCR，Ct值更低，结果更可靠；另外，表达量高的基因，其差异表达筛选时的准确性更高。原理不同，所以sequencing和RT-qPCR计算出来的变化倍数不可比，只要变化趋势相同即可。

总结，用来做RT-qPCR的差异表达lncRNA及引物设计区段的选取原则：

1.按lncRNA类型排序，优先选择lincRNA（基因间的lncRNA），和位于其他基因intron区的lncRNA；与其他基因exon有重叠的lncRNA，可选择其中无重叠的区段。

2.按FPKM或reads数排序，优先选择前50%的lncRNA。

3.按变化倍数排序，优先选择前50%的lncRNA。

注：具体限制多少FPKM或reads数或变化倍数，由整体测序深度和差异表达基因的数量决定，保留排在前面的一半左右，自己斟酌。

4.PCR产物所在的区段一定要在测序结果里看到明显变化的峰。

举两个例子：

在IGV里面打开bw文件，对满足以上原则的lncRNA，在IGV里逐个搜索，查看read分布。

栗子一：

下图这个lncRNA位于基因间区，有不同的isoform，其中一些exon的read数较多，如图中三个较高的蓝色峰，且在两个样品间有明显的变化，这三个峰所在的位置就适合设计引物。

怎样拿到序列呢？

点击IGV里的这个小图标，然后在你感兴趣的区段左边点一下鼠标，右边点一下鼠标，就出现红色的那一段了，在红色区域点右键，copysequence，粘贴到你的引物设计软件里，就OK啦！

栗子二：

每个sample有Forward和Reverse两个track，分别代表正义链和反义链，你能看到两条链上转录出来的不同的转录本。

下图这个lncRNA位于另一个蛋白编码基因的antisense（箭头标明转录方向），虽然gene结构注释认为lncRNA位于内含子区域，但其下游仍有较多的read分布，可能是基因结构注释的问题。标出红色的区域跟另一个基因的exon没有重叠，且在样品间能看到明显的差异，可以用来设计引物。

哪个引物设计软件好用呢？还要破解PP5吗？

嘿嘿！primer3足矣~