病原菌DNA测序鉴定的解释指南CLSI

柴海云张磊

作者单位：

广州金域医学检验中心有限公司（柴海云张磊）

一、简介

CLSIMM18-A《DNA靶基因序列分析鉴定细菌和真菌的解释标准；批准指南》（InterpretivecriteriaforidentificationofbacteriaandfungibyDNAtargetsequencing；Approvedguideline）是年由美国临床实验室标准化委员会（CLSI）制定的指南文件，介绍了基于广范围PCR（broad-rangePCR）的基因测序和序列分析在纯培养细菌和真菌鉴定中的应用，涉及了方法学、质量控制和结果解释等内容。

二、DNA靶向测序的方法

1、细菌PCR扩增引物

细菌的16SrRNA广泛引物的通用性强，能扩增几乎全部的不同种群细菌。并且，16SrRNA基因由不连续保守区和可变区组成，可变区进行序列分析可用于细菌种类的区分（图1）。

图1、16SrRNA和相关引物位置简略图示

注：绿色为可变区，黑色为保守区的引物位置

由于细菌16SrRNA基因的前bp的变异较大，包含了丰富的种属信息，CLSIMM18-A建议采用正反引物4f和27f、反向引物r和r的引物组合进行PCR扩增和测序分析（引物序列见表1）。但在某些情况下，尤其在科研论文和新种的分类研究中，采用27f-r测序其全序列是十分必要的。

表1、细菌16SrRNA基因扩增引物

引物名称序列(5’-3’)正向引物4fTTGGAGAGTTTGATCCTGGCTC27fAGAGTTTGATCMTGGCTCAG反向引物rTACCGCGGCTGCTGGCACrGGCGTGGACTTCCAGGGTATCTrGGTTACCTTGTTACGACTT

16SrRNA基因测序的优势是引物的通用性好，一对引物几乎能扩增全部的细菌。但缺点是对于临床一些常见的复合群，如类鼻疽霍尔德菌复合群、结核分枝杆菌复合群、龟-脓肿分枝杆菌复合群等，无法鉴定到种。故对于特定的属或某些微生物菌群，CLSIMM18还提供了16SrRNA基因外靶向基因，这些基因包括：recA、rpoB、tuf、gyrA、gyrB和cpn60等。但需注意的是，这些靶向基因的引物并不都是通用的，只适应用于特定的菌属或菌科。

2、真菌PCR扩增引物

CLSIMM18推荐的真菌广谱PCR扩增的基因主要有真菌ITS区间、28SrRNA基因D1/D2区，其他可用于部份真菌鉴定的靶向基因，如β微管蛋白基因或者是EF-1α基因，具体的引物见表2。

表2真菌靶向扩增引物

基因名称引物序列(5’-3’)ITS正向ITS-1TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS-5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG反向ITS-4TCCTCCGCTTATTGATATGCD1/D2区正向NL-1GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG反向NL-4GGTCCGTGTTTCAAGACGGEF-1α（用于镰刀霉的鉴定）扩增引物正向

EF-1

5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC

反向

EF-2

5′-GGARGTACCAGTSATCATG

测序引物正向

EF-3

5′GTAAGGAGGASAAGACTCACC

反向

EF-22

5′AGGAACCCTTACCGAGCTC

β微管蛋白（用于Phaeoacremonium的鉴定）正向

T-21

5′GGTTTGCCAGAAAGCAGCACC

反向

Bt2b

5′ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC

3、序列分析和解释

测序结果分析时，需与公共核酸数据库(如GenBank)中质量可靠（没有尚未识别的核苷酸或人工间隙）和来自有良好信誉的实验室的模式菌株进行比对。如在临床中发现了新的菌种，临床实验室应为临床医生提供一个比较熟悉的微生物结构。细菌16SrRNA基因序列鉴定细菌的通用解释标准见表3。

表3、16SrRNA基因序列鉴定细菌的通用解释标准

注：分枝杆菌与放线菌除外

三、病原菌的鉴定

CLSIMM18综合了rRNA靶基因测序、其他靶基因测序和细菌的生化反应的方法，其鉴定策略如下：①测序细菌16SrRNA基因，确定亲缘关系相近的菌种或系统发生邻居；②通过其他靶基因测序或细菌的生化反应的方法，对亲缘关系相近的菌种或系统发生邻居进行鉴别。

CLSIMM18的涉及病原菌种类主要包括：葡萄球菌和其他革兰阳性球菌，链球菌、肠球菌和似链球菌微生物，肠杆菌科，非发酵葡萄糖革兰阴性细菌，弯曲菌，革兰阳性厌氧菌，革兰阴性厌氧菌，棒状杆菌，需氧放线菌，分枝杆菌，生物恐怖菌，真菌等12个小节的内容（后继将一一进行推送）。

四、小结

CLSIMM18文件的本身有局限性，内容相对较窄，主要涉及与临床感染有关的常见病原菌，许多少见的病原菌不在该指南的范围。其次，基因测序对人员的要求较高，不适应用普通的临床实验室。并且，对于不懂细菌分类的分子生物学技术人员而言，结果的解释亦存在难题，因为现今的一些医学菌种并没有参照现今的物种的定义（见你知道吗？在遗传学的角度上，布鲁属只包括一个种!肠杆菌科细菌分类：大肠埃希菌和志贺菌（分类关系的答案））。再次，该指南制定于年，鉴于分类学研究的日新月异，部份的鉴定原则已经无法适用新的分类要求。

好的消息是，新出现的序列分析数据库，如ezbiocloud（







































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