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实验技巧3小时完成SingleCell基
揭示单细胞水平上的基因序列改变和基因表达差异在癌症研究、胚胎发育、干细胞研究等领域有着非常重要的意义，每一个细胞都是独一无二的，大多数在组织样品和细胞群体上开展的研究使得单个细胞的异质性被平均值掩盖。随着技术的发展，越来越多研究人员开始挑战单细胞的分析。
至少有三个技术难点：
●单个细胞的DNA和RNA怎么获取，传统抽提方法显然是不行的
●单个细胞的核酸太少，如何解决检测灵敏度和重复性的问题
●如果是要研究多个基因，核酸样品量不够怎么办
Bio-Rad提供2套非常详细的技术方案来解决以上问题。
前面单细胞的分选，都是使用Bio-Rad自动流式细胞分选仪S3e来操作的，将细胞分选到8联管中。后面的实验一个是基于qPCR技术，一般实验室都能做，在此简称“大众方案”；另一个是采用微滴数字PCR技术，因为数据精确度更高，简称“精准方案”。
大众方案●第1步：裂解单个细胞
准备4ul特殊buffer（内含专用SingleShotCellLysisBuffer）加入到8联管的每个孔，单个细胞直接分选入每个孔中，振荡混匀后经过25分钟孵育即可进行下一步。
●第2步：cDNA合成
准备1.5ul灵敏度极高的iScriptAdvanced反转录预混液加入以上细胞裂解液中，孵育21分钟得到cDNA。
●第3步：预扩增放大
直接得到的cDNA只有5.5ul，接着做qPCR要检测多个基因不够用啊！因此我们优化出一个PCR预扩增放大的方案，利用SsoAdvanedPreAmp试剂能同时用最多对引物将cDNA进行扩增，且序列偏倚极小，扩增后经稀释得到ul产物够至少75个qPCR反应，这下你做25个基因的检测都够了。当然根据待测基因的丰度，扩增后的稀释倍数可以更大，这样能检测更多的targets。
预扩增可以将极少核酸放大0倍。
●第4步：qPCR扩增
取2.5ul预扩增产品进行qPCR反应，建议使用SsoAdvanced系列qPCR预混液。另外利用iQMultiplexPowermix我们还验证过4重qPCR反应同时检测4个targets。
数据解读：使用本protocol单个拷贝的RNA大约Cq值在30。大于30通常认为是背景信号，可对比阴性对照来分析。
精准方案
这是基于微滴数字PCR技术平台，为啥说是精准方案呢？
因为qPCR是基于Cq值及标准曲线来定量的，太多因素会影响扩增效率及结果的准确性和重复性，尤其是单细胞水平的研究。微滴式数字PCRQX技术平台无需标准曲线，无需Ct值，采用先进的微流体技术将单个样品分成00个微滴来扩增并逐个检测微滴，实现了更高的检测灵敏度和更准确的定量计算。在癌症研究、病毒监测、基因组结构变异分析、基因表达分析、转基因研究和检测等领域表现出强大优势。
●第1步裂解细胞操作同上
●第2步：cDNA合成
和之前稍有不同的是加入了6ul的反转录试剂，得到共10ulcDNA，可以用于2次微滴数字PCR（ddPCR）反应。
●第3步：微滴生成和PCR反应
将20ul含cDNA、专用ddPCR扩增预混液、引物和/或探针及水的反应体系混合好后，和专用微滴生成油一起放入QX微滴生成器中，即可把20ul反应混合液变成00个微滴，然后再开始PCR扩增程序，每个微滴就开始单独扩增啦，这就是精确的绝密所在。
●第4步：微滴的检测和分析
这一步是QX微滴分析仪对微滴逐个进行荧光检测，经过分析软件直接告诉你每ul里有多少个target的拷贝。再说一遍，没有Cq值，不需要自己编公式算。
单个P19细胞向神经细胞分化的过程中基因表达分析结果
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