转录组相关问题小集锦

转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合（包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。），转录组测序(RNA-seq)是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录分析的方法,可以对全转录组进行系统的研究。

转录组测序可以供研究者在转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-codingRNA研究、miRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现等方面进行深入研究。

转录组分析是应运高通量技术快速获取可靠的转录组信息的方法，通过获得研究对象基因组转录区域的信息，鉴定转录发生位点，可变剪切等，其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。

转录组分析包括：编码基因的分析，翻译蛋白的预测，外显子内含子的剪切拼接，转录本的结构分析功能分析，二级结构等等，或者基因的差异表达

目前研究转录组的方法主要有三种：

1.基于杂交技术的cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片

2.基于sanger测序法的SAGE(serialanalysisofgeneexpression)、LongSAGE和MPSS(massivelyparallelsignaturesequencing)

3.基于第二代测序技术的转录组测序，又称为RNA-Seq

转录组测序结果的影响因素？

1）.RNA的降解严重影响测序的质量，RNA降解后，加入poly-A后无法捕获纯化mRNA，因此，随机引物反转录无法得到全部的cDNA，导致测序结果出现明显的3‘-和5’-偏向

2）.文库中的poly-A多聚物的存在会对测序信号产生干扰，影响测序结果的准确性

3）.同时由于转录组中转录本的丰度不一致，实验前需要对样本进行均一化处理，否则高丰度的表达基因会掩盖低丰度表达基因，导致寻找新基因失败或者是获得大量无意义的重复序列。

转录组测序比其他研究方法有哪些优势?（1）可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率的准确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题（2）灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本（3）可以对任意物种进行全基因组分析，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并准确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域（4）检测范围广，高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本

比较转录组可以认为是转录组denovo后的一类个性化分析，或者说是补充。主要包括的分析内容包括：（1）基因家族分析，给两个或多个物种统计基因家族的拷贝数（但基于RNA-seq数据的组装得出的结果，其实并不可靠）（2）单拷贝同源基因的Kaks分析，即选择压力分析；（3）基于单拷贝同源基因的物种进化关系分析。

很多Unigene和Contig注释上同一个基因，且同时有上调和下调的，为什么？？？

1，同一基因的不同区域2，同一个酶的不同亚基3，同源基因4，拼接错误（最不考虑）

转录组测序需要多大的测序量才能得到有意义的结果？转录组测序前，需要对物种转录组的大小进行评估，评估方法如下：（1）对于有referencegenome的物种，可以分析基因组信息，统计编码基因的个数，及其碱基数，从而估计物种转录组的大小，另外可以查询相关或相近物种转录组研究的文献，作为参考。（2）对于无referencegenome的物种则只能参考相近物种的转录组大小。由于转录组需要进行表达量的分析，因此在转录组测序中不推荐覆盖度，在进行不同基因和不同实验间的基因表达差异分析时，人们提出了RPM和RPKM的概念。RPM（ReadsPerMillionreads）即每百万reads中来自于某基因的reads数，考虑了测序深度对读段计数的影响。

RPKM（ReadsPerKilobasesperMillionreads）是每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数。因此，在确定转录组的测序量时，最好以产生的读长数目做依据，参照转录组大小，估计需要的读长数目，来确定转录组需要的测序量。

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