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实验小tiprealtimePCR知多
实时荧光定量PCR
（realtimePCR）
realtimePCR的英文全名是Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。
原理
1
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR可应用于：
（1）定量分析未知模板。
（2）单个或多个基因表达谱分析。
2
步骤
一、样品RNA的抽提：1、取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2、两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3、RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4、RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下rpm离心5分钟。
5、RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6.溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、RNA质量检测：1、紫外吸收法测定。
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:）后，读取其在分光光度计nm和nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定。
A下读值为1表示40ugRNA/ml。样品RNA浓度(mu;g/ml)计算公式为：Ax稀释倍数x40ug/ml。具体计算如下：RNA溶于40ulDEPC水中，取5ul，1:稀释至ul的TE中，测得A=0.21。RNA浓度=0.21xx40ug/ml=ug/ml或0.84ug/ul。取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35ul，剩余RNA总量为：35ulx0.84ug/ul=29.4ug。
（2）纯度检测。
RNA溶液的A/A的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2.变性琼脂糖凝胶电泳测定。
（1）制胶。
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10xMOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25mu;l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品。
取3ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
（3）电泳。
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照。
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
三、样品cDNA合成：
1、反应体系。
序号反应物剂量
1逆转录buffer2ul
2上游引物0.2ul
3下游引物0.2ul
4dNTP0.1ul
5逆转录酶MMLV0.5ul
6DEPC水5ul
7RNA模版2ul
8总体积10ul轻弹管底将溶液混合，rpm短暂离心。
2、混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5ul，37℃水浴60分钟。
3、取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR：1、β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为，反应前取3mu;l按10倍稀释（加水27ul并充分混匀）为，依次稀释至、、、、、，以备用。
2、反应体系如下。
标准品反应体系
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10ul
2阳性模板上游引物F0.5ul
3阳性模板下游引物R0.5ul
4dNTP0.5ul
5Taq酶1ul
6阳性模板DNA5ul
7ddH2O32.5ul
8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，rpm短暂离心。
3、管家基因反应体系：
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10ul
2内参照上游引物F0.5ul
3内参照下游引物R0.5ul
4dNTP0.5ul
5Taq酶1ul
6待测样品cDNA5ul
7ddH2O32.5ul
8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，rpm短暂离心。
4、制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。
五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板：
1、针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
2、配制反应体系后轻弹管底将溶液混合，rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72℃延伸5分钟。
3、PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
4、将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1times;，依次稀释至、、、、、几个浓度梯度。
六、待测样品的待测基因实时定量PCR：1、所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
七、实时定量PCR使用引物列表：
引物设计软件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
八、电泳：
各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
注意事项
1.荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用要结合扩增效率，线性回归系数等参数来综合考虑。
2.Ct值：在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。
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END
来源｜丁香园
编排｜吕敏佳
责任编辑｜苏中强
审核老师｜练雯
广州医科大学研究生院
