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晒一晒历年的973课题标书应该可以学
晒一晒历年的课题标书
一、关键科学问题及研究内容
1.拟解决的关键科学问题
本项目拟解决以下三个科学问题：
(1)研究癌基因、DNA甲基化基因和突变基因的结构和生物学规律，比较它们在疾病和正常细胞中的差异。
(2)解决核酸探针在疾病诊断中的特异性问题，设计、合成和筛选能特异性识别疾病基因靶点和多位点突变基因的探针分子。
(3)核酸适配子的高选择性灵敏诊断问题。通过化学方法修饰核苷序列或碱基而形成的结构多样性核酸适配子对肿瘤标志物和CTC特异性的识别可以大大提高，从而提高肿瘤疾病检测的灵敏度。
2．主要研究内容：
围绕上述三个科学问题，我们将开展如下几个方面的研究：
2.1致病基因结构与生物学功能研究
核酸分子的生物学功能由其性质、结构和它们与其它生物大分子的相互作用所决定。以富G核酸的特殊性质为基础，建立模拟基因组DNA复杂结构下G-四链体结构和构象的解析、示踪和干预的新技术，筛选和鉴定与富G核酸、G-四链体相互作用的小分子。发展上述过程的干预手段，为重要疾病提供诊断和治疗的理论基础。
(1)研究生理条件下富G核酸和G-四链体等高级结构的形成条件，以及表现出与疾病相关的性质。
(2)发展解析生理条件下富G核酸和G-四链体等高级结构构象的技术，为研究小分子探针与富G核酸和G-四链体的相互作用提供技术支撑。
(3)筛选、鉴定与富G核酸和G-四链体相互作用的化学小分子，研究小分子在生理条件下与富G核酸和G-四链体的相互作用、选择性识别及其生物学功能，为疾病诊断和治疗提供理论基础。
(4)富G核酸结构损伤检测与损伤识别修复机制，认识致病核酸的结构，寻找与疾病相关的核酸序列。
2.2针对致病基因的高灵敏、特异性小分子的设计与合成
针对癌基因、甲基化DNA、不规则核酸序列等致病基因的一级、二级和三级结构的特点，研究化学小分子与它们之间的相互作用，筛选出结合能力强、选择性高的化学小分子：
(1)以富含G核酸序列为靶点（例如，VEGF、BCL-2、Ki-ras癌基因启动子区和端粒DNA富G序列），设计合成和筛选具有识别功能的新型识别分子,如：氧氮杂环类大环和新型环状寡聚酰胺。在分子、细胞和动物水平上研究识别分子对上述癌基因启动子区G-四链体识别的特性和功能。
(2)针对DNA甲基化的基因靶点，主要是寻找能直接与甲基发生化学反应的小分子，可以达到识别DNA甲基化的基因序列的目的。
2.3分子探针对癌基因、甲基化DNA和致病基因的识别与调控
(1)以癌基因、突变基因和不规则核酸结构为靶点，基于化合物的特征性结构，研究小分子配体与特殊核酸结构的亲和作用，设计筛选出对致病基因序列具有特异的高亲和性化合物，进行光、电、色等功能化基团修饰制备分子探针；在分子水平上理解其作用机制，揭示小分子-核酸间的结构功能关系，在分子水平上理解其相互作用的特异性。结合细胞生物学，研究病变细胞和正常细胞修饰电极对特定探针的响应及响应的异同点。
(2)在得到设计合成的探针后，针对DNA甲基化的基因靶点，利用现有小分子的光或电或色响应等性质，直接与相关的DNA甲基化序列作用，通过相关的响应来检测DNA甲基化序列.在细胞水平上，我们可以通过利用DNA微阵列技术和PCR技术分析合成的探针分子处理细胞前后基因表达的差异变化，从而发现探针的作用靶基因。利用甲基化PCR以及bisulfitesequencing分析这些基因启动子区域甲基化水平的变化，研究探针分子对DNA甲基化基因的影响。
2.4对乳腺癌、肝癌识别的核酸适配子的设计与筛选
(1)利用SELEX技术自主筛选到的、能特异性结合乳腺癌、肝癌标志物或CTC的小分子核酸适配子，将核酸适配子与具有光、电、色特征的小分子通过化学方法连接，建立乳腺癌、肝癌分子诊断新技术。
本研究将采用的CS-SELEX（Cellsurface-SELEX）技术是将肿瘤细胞作为筛选介质的一种新型SELEX筛选方法，例如我们将表达多天线的复杂型N-糖苷的肿瘤特异性抗原靶分子的乳腺癌细胞并作为阳性正筛细胞获得靶分子，没有表达靶分子的同系细胞作为阴性反筛细胞消除非靶分子，获得特异性针对乳腺癌肿瘤细胞特异性抗原靶分子的适配子。通过化学计算、分子模拟和分子设计，进行适配子与靶分子对接分析与自适应识别研究，建立相关理论模型，并利用这些模型和机制评估、设计新的核酸适配子分子探针。
(2)为了解决目前核酸适配子（DNA和RNA）的结构稳定性和特异性，我们将对筛选到的寡核苷酸结构进行化学修饰，主要在下面几个方面开展相关工作：针对RNA目前面临的主要问题开展RNA或DNA化学修饰、体内输送系统研究以及RNA文库设计和靶标筛选研究。
1)化学合成带有氨基及其它修饰的异核苷并用于掺入短链RNA或DNA适配子上，希望提高它们的稳定性，提高其在血液中的保留时间；设计合成肽类、脂类等人类天然存在的化学成分缀合的RNA适配子，研究解决RNA适配子细胞膜通透性和RNA适配子靶向组织细胞的问题。
2)构建另一种形式的RNA和DNA库，筛选能对人类肿瘤标志物能特异结合的RNA和DNA混合文库。
3)对筛选的理想核酸适配子进行化学修饰，构建电、光、色等功能化核酸适配子探针，建立基于这些分子探针的单个癌细胞的检测方法和对肿瘤细胞组织的高灵敏成像方法。
2.5.基于核酸探针的肿瘤重大疾病的特异、灵敏诊断研究
主要研究的内容包括：设计并合成能对肿瘤等重大疾病突变核酸特异性识别的小分子，实现对肿瘤相关基因的诊断：
(1)设计并合成能对肿瘤中的致病核酸进行诊断的探针。针对肿瘤(相关)基因序列、DNA甲基化序列以及一些常见的突变位点，设计相应的不对称拆分-组装DNA过氧化物酶探针，通过DNA过氧化物酶催化的显色反应实现对靶核酸及耐药突变的均相检测，另外还将设计能够信号级联放大的DNA过氧化物酶检测体系，实现无需PCR扩增直接检测DNA序列。进一步将设计的DNA探针与微流控芯片技术相结合实现将血液样品直接加入芯片实验室的进样口，即可进行癌症的快速核酸诊断。对我们课题一、课题二所发现和筛选的能对不同疾病能特异识别的生物探针进行光或电或色响应修饰，实现通过光或电或色响应来检测相关致病基因片段，达到检测的目的。
(2)肿瘤性疾病的无创性诊断。最初在血浆中检测到的肿瘤基因突变有在胰腺癌和大肠癌中出现的K-ras基因的突变，它们是随着肿瘤细胞的坏死释放到血浆中去的。血浆DNA的p53基因的突变可以用于肿瘤的复发和转移的早期标志物，加强血浆DNA的富集技术，检测出肿瘤的变异基因，有很好的无创性诊断的价值。(3)目前基于CTC的肿瘤检测靶标（EpCAM）属广谱肿瘤检测靶标，且部分肿瘤不表达该靶标。我们拟采用利用SELEX技术，根据不同肿瘤选择相应CTC特异性的核酸适配体，作为该特定肿瘤（主要针对乳腺癌和肝癌）的CTC靶标，获得的核酸适配体序列可在合成过程中进行各种修饰如氨基修饰作为芯片探针，荧光素或量子点修饰作为荧光探针。为了解决CTC单细胞后期分析方法受限于模板量微少，无法进行的技术难题，尝试扩增CTC基因组，实现微量模板扩增，(本课题组已有单细胞全基因组直接扩增技术)，便于后期分子生物检测的进行。本项目将样本处理、反应部分集中于微小基片上，外部只保留通用结果检测设备，能最大限度减小体积，实现便携，同时可将多个反应室和多个样本处理室结合于单一微小基片上，实现同一样本高通量检测多个项目，以及多个样本高通量检测，有很好的临床应用前景。
2.6.对肝癌、乳腺癌的预后判断和指导个体化治疗
尝试从三个不同的层次和水平进行肝癌、乳腺癌的早期预警和辅助个体化治疗
1)采用已经确认的靶标：如：肝癌个体化治疗相关的CDA、BRAF的基因突变；乳腺癌的高表达基因Bcl2是否上调。采用小分子探针检测这些基因是否存在突变进行识别和检测。
2）检测DNA甲基化表达量，在患者外周血浆中，筛查肝癌、乳腺癌组织特征性的甲基化DNA分子。
3）采用外周循环肿瘤细胞检测技术，检测外周血循环肿瘤细胞数量，评估患者的预后和指导个体化治疗。
二、预期目标
(一)总体目标：
通过本项目的研究，建立起基于核酸的重大疾病特异、灵敏诊断的创新性关键科学技术，发现若干针对肿瘤重大疾病的特异性、专一性、高灵敏度核酸探针，为进一步解决对这些疾病特异、高灵敏检测所面临的瓶颈性问题提供理论依据和技术。本项目的完成将为与核酸相关的众多重大疾病的早期预警和诊断，并进一步为肿瘤的预后判断和指导个体化治疗的提供理论基础与技术保障，为我国具有自主知识产权的疾病诊断研究和开发提供理论依据和新技术，为提高人类健康水平和促进我国医疗产业的国际竞争力作出贡献。本项目将始终面向医学基础和重大疾病诊断，以创新为基础，以国民健康为己任，培养一支在化学、生物学和医学广泛交叉的核酸领域研究人才队伍，为我国疾病诊断的创制水平、应对重大疾病能力、维持医疗体系稳定和促进国民经济可持续发展打下坚实的学科、理论和人才基础。
(二)五年预期目标
1．面对传统重大疾病诊断存在的根本性缺陷问题，建立以核酸为靶目标的用于生命科学、临床医学中肝癌、乳腺癌等检验、快速诊断新策略和技术。
2．对不同类型核酸靶点的生物和医学问题研究，发现不同结构核酸在疾病的发生和发展中所起的重要作用；筛选能对致病核酸序列（富G序列的癌基因、DNA甲基化基因和突变基因）高选择性识别的小分子，研究它们与不同结构核酸的相互作用和结合能力，通过修饰得到生物分子探针和微型化芯片实验室，筛查重大疾病的易感基因，并进一步研究和开发其在肿瘤疾病的灵敏诊断技术，并为肿瘤预后判断和指导个体化治疗的提供理论基础与技术。
3．设计并合成能针对肿瘤细胞中标志物或CTC进行特异识别和结合的核酸适配子分子，通过化学修饰后使其具有光、电、色等特性，用于肿瘤疾病的高灵敏诊断。
4.设计、合成和发现化学衍生试剂，衍生化癌变过程生物标志物，提高检测灵敏度，建立质谱法高灵敏度检测人类癌变过程生物标志物的新方法。
5.肿瘤疾病的致病基因结构的灵敏和特异检测，为进一步开展肿瘤预后判断和个体化治疗提供理论和技术支持。
(三)量化考核指标
1．研究化学小分子与富G核酸、G-四链体DNA的相互作用，筛选和发现5~8个对富G核酸具有特异性识别功能的化学小分子探针。
2．获得一些新型的多功能纳米标记材料和纳米生物探针，研究得到对特殊核酸结构及序列高度选择性高结合能力的配体,在分子水平上认识了解小分子-核酸配合物的高分辨结构信息。
3．合成并筛选能对肿瘤的VEGF、BCL-2、Ki-ras癌基因特异性识别的探针分子，发展一些高通量、低成本、简便快捷的核酸检测的技术，达到对重大疾病高效、早期诊断提供理论依据的目的。
4．通过使用色谱和质谱技术以及相关的生物技术手段，分析细胞在探针分子处理DNA甲基化基因或癌细胞之后，基因组或全基因组范围胞嘧啶的甲基化变化，特定基因启动子区域甲基化水平的变化，DNA甲基化转移酶以及组蛋白的修饰，从表观遗传学上阐明探针分子的识别机制。
5．针对乳腺癌、肝癌的标志物或CTC，通过SELEX技术筛选能特异识别的核酸适配子小分子，通过化学修饰，结合上具有光、电、色的化学物质，能对乳腺癌、肝癌细胞进行甄别和检测。
6．合成结构修饰DNA或RNA，但保持其作为核酸适配子的特异性和高结合能力，并在体内更稳定且能穿透细胞膜；研究一类能准确地输送DNA或RNA到靶部位的输送体系;使结构修饰的DNA或RNA选择性地作用于靶目标；构筑一个通用的DNA和RNA文库并用于寻找药物靶标、功能基因及背后隐藏的生理或病理过程的研究。
7.设计、合成和筛选1-3个化学衍生化试剂，对癌变过程的生物标志物进行衍生化，提高检测的灵敏度，建立HPLC-ESI-MS法高灵敏度检测人类癌变过程生物标志物的新方法。
8．在国际著名期刊上发表有较大影响的学术论文，并申请相应的知识产权，发表高水平SCI论文60篇以上，申请专利10项。
9．培养本领域的学术带头人6人以上，培养博士生60人，博士后10人。
三、研究方案
（一）学术思想及技术路线
本项目根据恶性肿瘤重大疾病的发病机制，针对正常细胞在病变过程中首先正常的核酸将受到入侵或受其它物理、生物、化学方面的影响而发生异常，导致机体受感染或发生遗传方面的错误表达，最后发生病变这一长期处于潜伏状态的过程，设臵相关课题和研究内容，以核酸发生异常为主要目标进行疾病诊断的研究。核酸在发生异常后，会导致核酸结构发生多样化，因此设计合成相应的小分子探针对特殊核酸结构进行特异性的识别和调控，在分子水平上理解其作用机制，揭示小分子-核酸间的结构功能关系；此外，富G核酸的癌基因的生物学功能及其性质、结构被认为是目前肿瘤等重大疾病诊疗中可能取得突破性进展的热点，人们已发现能够形成G-四链体的富含G核酸序列在人和其它物种的基因组中有几十万之多，它们与癌症等许多重要的疾病有重要关系；DNA甲基化序列也是导致肿瘤发生的重要原因，对DNA甲基化序列的特异性识别，可以提高我们对肿瘤疾病的高灵敏、特异诊断。因此，筛选和鉴定富G核酸和DNA甲基化序列相互作用的小分子，研究它们与致病核酸的相互作用规律，经过对特异性结合的小分子进行修饰得到探针分子，可作为诊断的工具对疾病进行灵敏诊断。与此同时，为了提高对肿瘤标志物的检测灵敏度，我们还将通过SELEX技术筛选的核酸适配子和结构化学修饰的核酸适配子，经过对它们化学结合具有光、电、色等性质的小分子，可以对肿瘤疾病进行诊断和预警，为进一步在临床上进行疾病检测打下理论基础和提供相关的技术支撑。
在技术路线上，本项目将从变异性核酸的结构入手，通过化学的理论和方法设计并合成对目标核酸具有特异性识别和结合的化学小分子探针；同时利用SELEX技术筛选能对肿瘤标志物或CTC有特异识别的核酸适配子分子，为了保证它们在体内的稳定性，对它们的结构进一步修饰，再结合上具有光、电、色的化学小分子。通过分子生物学、细胞生物学和医学等理论和实验技术，研究它们对不同结构核酸的相互识别作用、疾病灵敏诊断的特异性，研究它们对致病基因特异性识别的能力，进一步研究疾病早期预警和高灵敏诊断。课题一、二是针对不同结构的致病基因所设计的探针分子，课题三则是对课题一、二中筛选的特异识别的小分子进行光、电和色响应基团的修饰，得到可以对疾病检测的探针分子，课题四是针对肿瘤标志物及CTC设计合成的核酸适配子，并同样进行光、电和色响应修饰。在课题一、二、三、四的基础之上，本项目将进一步发挥核酸分子探针的作用，面向医学基础和重大疾病，基于核酸探针进行重大疾病快速、专一、高灵敏的诊断技术研究（课题五）。本项目的研究成果将对恶性肿瘤重大疾病目前快速、高灵敏诊断中面临的种种瓶颈性难题找到更优化的解决方法和关键技术。
（二）本研究项目实现预期目标的可行性
1．理论依据可靠：核酸的重要性在现代生物学研究中已经得到证实，核酸的损伤与传染性疾病、肿瘤的发生也已经被深入理解，后基因时代的研究发现核酸的结构和生物学功能的研究对生命科学、医学和药物研发领域的发展有很强的推动作用，近些年来诺贝尔奖在核酸领域的倾向性也让核酸的研究越来越受到人们的鐧界櫆椋庡湪绾垮挩璇?鍖椾含鐧界櫆椋庣殑鏈�濂藉尰闄?
