干货运用PrimerBlast设计和

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　　Primer-BLAST整合了Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。更强大的是Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。Primer-BLAST有许多改进的功能，比单个的用Primer3和NCBIBLAST更加准确。

　　Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括4部分：PCRTemplate（模板区）,PrimerParameters（引物区）,Exon/intronselection（外显子内含子设置）和specificitycheck（特异性验证区）。

（1）模板（Template）

　　在“PCRTemplate”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用AccessionNumber。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificitycheck区选择）是唯一的。

（2）引物（Primers）

　　如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在PrimerParameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificitycheck区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm值等。

（3）外显子内含子（Exon/intron）

　　如果你想设计的引物是跨内含子和外显子的交接处，在这里可以设置成primermustspananexon-exonjunction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。

（4）特异性（Specificity）

　　在specificitycheck区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了7种数据库：

RefSeqmRNA，Genome(referenceassembliesfromselectedorganisms)，RefSeqrepresentativegenomes，RefSeqRNA(refseq_rna)，nr(thestandardnon-redundantdatabase)，Genome(chromosomesfromallorganisms)和custom。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。

　　最后建议用oligo6或primer5验证引物自身的特性：发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体，△G的绝对值。

三、具体操作演示分析

　　Gene：PTEN,phosphataseandtensinhomolog(Homosapiens)

Accessionnumber：NM_

　　步骤1：按下面截图输入NM_.4和设置PCR产物大小70-，其他默认：

　　步骤2：点击GetPrimers，跳出以下界面（界面运行中）：

　　等待一段时间后会出现以下界面，有多条引物显示出来，一般选择primerpair1：

Tips：

1．在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession号（尽量不要Fasta格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填AccessionNumber时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）

2．就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用Gi号或Accession号。因为用Gi号或Accession号，NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。

3．尽量使用没有冗除的数据库（eg:refseq_rna或genomedatabase），nr数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。

4．请指定一个或几个PCR扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。

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