PBJ利用Cas9核糖核酸蛋白在工业

基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术已被广泛应用于多个物种。与传统的转基因方法相比，其通过直接传递核糖核算蛋白进行的基因组编辑具有很多优点，包括效率高，用时少，减少脱靶效应和低细胞毒性等。此外，无转基因基因编辑生物可能会绕过目前适用于食品和医疗应用的转基因生物法规，如作物分子育种和微藻类植物。然而，由于基于DNA-free的基因组编辑技术在微藻类中无筛选突变效率低，因此无转基因基因组编辑技术在实际应用中还需要进一步完善。

纤细裸藻是一种单细胞光合鞭毛虫，也是一种工业开发的微藻，它富含营养元素，积累大量的裸澡淀粉，具有多种生物活性功能。因此，大量培养的纤细裸藻是功能性食品、饲料和化妆品的商业来源。此外，在厌氧条件下，裸藻淀粉可被降解并转化为肉豆蔻酸和肉豆蔻醇的主要组成成份蜡酯。由于纤细裸藻产生的蜡酯很容易转化为具有低冰点的生物燃料，所以非常适合作为生物喷气燃料的原料。尽管纤细裸藻作为一种可再生资源具有很多优异特性，但建立其有效的定向诱变一直是一个长期的挑战。

年5月26日，PlantBiotechnologyJournal杂志在线发表了日本理化研究所可持续资源科学中心题为"Highlyefficienttransgene-freetargetedmutagenesisandsingle-strandedoligodeoxynucleotide-mediatedpreciseknock-inintheindustrialmicroalgaEuglenagracilisusingCas9ribonucleoproteins"的研究论文。

为了在纤细裸藻中建立了一种基于Cas9核糖核酸蛋白（RNPs）的无转基因突变方法，该研究在纤细裸藻葡聚糖合成酶2（EgGSL2）基因的第二个外显子内设计了两个靶序列，推测该基因参与了裸澡淀粉的生物合成，使用电激转化仪将Cas9核糖核酸蛋引入目标区域发挥作用。检测证明这两种以EgGSL2为靶点的RNPs可以使纤细裸藻细胞表现出更少但更大的裸澡淀粉颗粒(图1c)。靶1和靶2表型改变的平均频率分别为71.3%和80.6%(图1d)，插入缺失突变率为77.7-86.8%和88.8-90.1%。此外，在EgGSL2中同时引入两个针对不同位点靶标1和靶标2的Cas9RNPs，在靶标之间产生约bp的缺失(图1h和i)，表明在纤细裸藻能够生成靶标区域的长片段缺失突变体。

为进一步推进基于Cas9RNPs的基因组编辑技术在纤细裸藻中的研究，该实验室又开展了一个精确的单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）介导的敲入实验。该实验使用EgGSL2靶点2，Cas9RNPs和ssODNs作为同源臂，其中包括EgGSL2靶点2切割位点上游和下游的50个nt，以及一个包含EcoRI、EcoRV和BamHI位点的42nt的敲入DNA片段。利用这些限制性内切酶消化ssODNs处理的纤细裸藻样品，检测发现有效的敲入事件发生(图1k)。此外Sanger测序也发现，在35个随机克隆PCR产物中鉴定出24个产物的敲入序列来自于设计的靶区ssODN(图1l)。这些结果表明ssODNs介导的敲入实验对纤细裸藻具有足够的应用价值。

该研究利用Cas9核糖核酸蛋在纤细裸藻中开发了一种高效的无转基因靶向诱变和单链寡脱氧核苷酸介导的敲入技术，为纤细裸藻是一个基因组可编辑的生物体提供了第一个证据。也为阐明其他裸藻类的基因功能提供了一个突破，并为改善其工业上的重要特性开辟了新的途径，促进生物材料生产的可持续性发展。

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