聊一聊引物和PCR在冠状病毒检测中的应用

历时近两个月的新型冠状病毒以迅猛之姿横扫神州大地，牵动了数以亿计中国人的心。全社会投身在这场战”疫”中，众志成城，上下一心，竭力支持疫情防控。新增疑似病例在各界人士的共同努力下已连续多日降低，相信这场战”疫”很快就能迎来曙光。

此次疫情中，赛默飞整合多个产品线提供了完整解决方案，从核酸提取到检测，涉及多种试剂、耗材和仪器，而引物作为PCR反应体系中不可或缺的原料之一同样起着重要作用。

众所周知，PCR反应的关键因素主要有核酸模板的制备，引物的质量与特异性，酶的扩增能力，PCR退火温度。若实验结果未达到预期，一般都会从上述因素中寻找原因并进行分析。我们通常习惯将模板、酶、反应条件作为突破口来寻找原因，往往容易忽略掉引物这个因素，它虽然只有短短几十个碱基，对PCR反应的影响却不容小觑。

这一次，我们就想跟您聊聊引物在PCR反应中的那些事儿。

一般来说，PCR失败主要可以归纳为以下几类：

01

假阴性或无扩增产物

是指PCR产物中无扩增产物或条带不理想，通常会考虑以下几个因素：DNA模板纯度低、酶失活、引物质量差或设计不合理、变性温度过低或时间过短、Mg2+浓度过低等。在进行新冠诊断的时候，若产生假阴性则会造成误诊，传染更多的人群，从而产生严重后果。

针对引物造成的假阴性，主要解决方案有：

1.选择质量稳定的引物合成公司。

2.对设计不合理的引物进行重新设计合成。

3.保存引物时应高浓度小量按照推荐温度分装保存。

02

出现非特异性扩增带

主要表现为PCR扩增后出现的条带与预期的大小不一致，或者同时出现特异性与非特异性扩增带。其原因主要有：引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体，Mg2+离子浓度过高，退火温度过低以及PCR循环次数过多，酶量过多或酶的质量差。

针对引物造成的非特异性扩增，主要解决方案有：

1.必要时重新设计引物。

2.适当降低引物量。

03

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时会出现涂抹带或片状带或地毯样带，其原因往往是酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起的。主要解决方案有：1.减少酶量，或更换为另一来源的酶。2.减少dNTP的浓度。3.适当降低Mg2+浓度。4.调整模板用量，减少循环次数。　

04

假阳性，即空白对照出现目的扩增产物

假阳性的出现，意味着存在靶序列或扩增产物交叉污染的可能性。这种情况若出现在新冠诊断中，则会造成检测人员重新检测，不仅增加工作量，还会延误诊断。

引起这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染。如果扩增序列与非目的扩增序列有同源性，同时靶序列太短或引物太短，都可能导致PCR扩增出非靶序列的片段，此时就需重新设计引物。

二是核酸气溶胶污染。这些核酸小片段通常比靶序列短，但却具有一定的同源性。主要解决方案有：

1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管和带滤芯吸头等均应一次性使用。

3.必要时，在加样本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

为全力支持新冠病毒检测用引物和探针的生产，赛默飞制造工厂大力加强防污染管控，暂停所有全基因合成订单的生产，24小时运转提高产能，修饰探针%质谱检测，以确保序列准确。同时，在与病毒“赛跑”的争分夺秒中，我们也给科研人士们开通了一条“绿色通道”。

此次疫情相关的引物和探针订单我们将优先安排，尽一份绵薄之力。您的相关订单如需优先安排，请告知对应的销售代表，以便协调快速上机合成。

赛默飞的“忠粉”们一定知道，赛默飞旗下Invitrogen引物合成服务在中国已经走过了20个年头，我们在20余年的专业DNA合成中积累了丰富的经验和良好的业内声誉。多年来，我们的产品以稳定的品质和严格的管理规范受到广大科研工作者们的青睐。为应对这场疫情，我们已做好万全准备，欢迎来下单。

附中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所公布的新冠病毒核酸检测引物和探针序列信息：

图片信息来源：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

后记

病毒面前，人类虽脆弱且渺小，但我们有不懈的努力和必胜的决心，胜利就在不远处。

中国加油，武汉加油！

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