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SciAdvancesCas9寡
大家好，今天推荐一篇发表在SciAdvances上的文章，通讯作者是医院的李默研究员和北京大学药学院的刘涛研究员。
Theclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)–CRISPR-associatedprotein9(Cas9)system，即CRISPR/Cas9系统。它是细菌和古生菌抵抗噬菌体感染和外源DNA入侵的一种适应性免疫防御，通过将入侵的DNA片段整合进CRISPR中，经转录和酶处理得到CRISPRRNA(crRNA)，再与trans-activatingcrRNA(tracrRNA)形成复合物，结合Cas9核酸内切酶，引导其切割与crRNA互补配对的外源DNA。另外，crRNA和tracrRNA形成的复合物也可以设计成一个单一的向导RNA(guideRNA,gRNA)，与Cas9预组装形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)，并直接递送到靶细胞中，不仅简化了系统而且保留了Cas9靶向切割DNA的功能。
在哺乳细胞中DNA双链断裂(double-strandedbreak,DSB)主要有两种修复方式：非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)和同源定向修复(homology-directedrepair,HDR)。其中，NHEJ是主要途径，通过DNA连接酶直接将DSBs末端连接，可能会导致片段的插入和缺失，实现基因的敲除。HDR则是复杂且精确的，需要以供体的同源序列作为模板进行基因编辑。与NHEJ相比，HDR的效率低，并受细胞类型和细胞周期的影响。目前，已有多种方法被用来提高HDR效率，如对gRNA进行化学修饰以提高其稳定性和减少脱靶效应；在gRNA和单链寡脱氧核苷酸(single-strandedoligodeoxynucleotide,ssODN)模板之间利用生物素-链霉亲和素珠的高亲和力，或者通过Cas9上的一个融合蛋白与ssODN的共价连接，形成RNP-供体DNA复合物，以提高供体DNA模板的局部浓度。然而，对Cas9化学修饰的研究很少。
在本文中，作者使用基因密码子扩展技术对Cas9进行化学修饰，位点特异性地连接寡核苷酸，发展了一种在RNP上招募经化学修饰或未修饰的ssODN的方法，显著提高了在人源细胞和小鼠受精卵中HDR的效率。
首先，作者根据StreptococcuspyogenesCas9(SpyCas9)的结构，选择了11个ncAA的引入位点（图1A），并在大肠杆菌BL21中利用MjPolyRS/tRNACUA对AeF（图1A）的引入效率进行评估。结果发现在这11个变体中，K-AeF和G-AeF有较高的表达水平（图1B），并通过串联质谱分析证实了AeF的引入。随后，作者分别在体外和细胞内证明了Cas9经化学修饰后，不会影响其靶向切割DNA的活性（图1C、1D）。
图1：A:AeF和SpyCas9与gRNA(PDB:4OO8)的结构。B：Cas9变体的胶图。C：WTCas9和Cas9变体对双链DNA的核酸酶活性。D：WTCas9和Cas9变体对HEKTetonEGFPcells的基因组编辑。
之后，作者利用炔-叠氮环加成反应，将DBCO修饰的供体ssODN共价连接到上述Cas9变体，以进行基因的敲入（图2A）。ssODN共有-nt，其中36-nt编码HiBiT报告标签，两端各75-nt为GAPDH基因的同源序列。HiBiT是一个短肽，能与LgBiT高亲和力结合，并在底物furimazine存在下发光，可以高敏感度地定量HDR效率。作者首先研究了在体外G-AeF与DBCO-ssODN的反应条件（图2B），发现二者摩尔比为1:5时转化率接近50%。其次证明了Cas9-ssODN复合物不会影响Cas9的活性，以及有DBCO修饰的ssODN使HDR效率提高了1.6倍（图2C）。
图2：A:Cas9-ssODN的形成以及提高HDR效率的示意图。B：Cas9G-AeF与DBCO-适配体或DBCO-ssODN反应的胶图。（1）Cas9G-AeF（2）Cas9G-AeF：DBCO-适配体，1:1（3）Cas9G-AeF：DBCO-ssODN，1:1（4）Cas9G-AeF：DBCO-ssODN，1:3（5）Cas9G-AeF：DBCO-ssODN，1:5。C：HEK细胞的HiBiT分析。
然后，作者设计了一个3’-DBCO修饰的25-nt的寡聚核苷酸，并于AeF修饰的Cas9偶联，以通过碱基互补配对，实现在RNP附近招募ssODN来提高HDR效率（图3A）。作者经上述反应得到Cas9G-AeF-寡聚核苷酸的共轭物（图3B），分别在体外和细胞内证明了Cas9的活性。通过电泳分析，作者发现向上述复合物中加入ssODN后发生了条带移动（图3C）。随后作者将其整个混合物转染到HEK细胞，通过HiBiT分析，HDR效率有10倍的增加（图3D）。另外，测序结果与HiBiT分析一致。该方法也适用于Cas9D-AeF–G-AeF同时连接两个寡聚核苷酸链的情况，HDR效率是单个适配体的两倍。
图3：A:Cas9-适配体的形成以及提高HDR效率的示意图。B：Cas9变体与DBCO-适配体反应的胶图。C：Cas9或Cas9-适配体与ssODN孵育后的胶图。D:HEK细胞的HiBiT分析。
最后，作者将该方法应用于小鼠受精卵，也实现了基因的精准敲入。
综上，作者们开发了一种提高CRISPR/Cas9系统HDR效率的方法，有助于CRISPR的进一步推广和应用。
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