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PCRRTPCR实时PCR
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速、大量扩增的方法，此技术获得年诺贝尔化学奖。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。
——KaryB.Mullis
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PCR介绍
PCR反应条件1、PCR反应成分（1）模板a、形式单、双链DNA均可b、纯度蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应
c、浓度一般ng/μL，过高会导致非特异性扩增增加d、完整性模板降解会导致PCR扩增无产物（2）引物a、设计长度适当、避免二级结构和二聚体b、完整性避免反复冻融
c、浓度0.1-1.0μmol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降；过低扩增产物太少
（3）ddH2O补足体系，pH值适当，避免污染（4）反应Buffer
a、pH、盐离子、稳定剂、增强剂b、提供缓冲环境
（5）Mg2+
a、浓度0.5-2.5mmol/L，DNA聚合酶的激活剂。浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；过高非特异严重。
b、可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
（6）dNTP
a、浓度一般20-μmol/L，四种应相等，浓度取决于扩增产物的长度，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。
b、避免反复冻融（7）TaqDNA聚合酶
c、浓度0.5-2.5U/50μl，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
2、PCR反应循环参数（1）变性-使双链DNA解链为单链-93-95℃，20-30秒-变性温度低、解链不完全是PCR实验失败主要原因
（2）退火-温度40-60℃，由引物长度和GC含量决定，一般Ta=Tm-3~5℃-增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度可增加反应的灵敏性。-时间30-60秒
（3）延伸-温度70-75℃,一般为72℃，温度过高不利于引物与模板结合-时间由扩增片段长度决定，1kb以内，1min足够，延伸时间过长引起非特异，但对于低浓度模板扩增，需延长时间。
（4）循环次数-主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次-次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加
PCR引物设计a、引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。b、引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
1、设计原则首先序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（1）长度?引物的长度一般为15-30bp，通常18-24bp，但长片段扩增时，引物长度30-35bp。?引物过短易引起错配现象。例：一个12bp的引物在人类基因组上存在个潜在的退火位点，而20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/个。较长的引物（28-35bp)，还常用来区分同源性较高的模板序列或者用于产生一些突变位点。
（2）GC含量?引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。（3）结构?尽量避免引物序列形成发夹，特别是3’端。尽量避免引物间形成二聚体、特别是3’端前3个碱基间不能有二聚体。避开局部富含GC或AT，3’端避开连续同样的碱基，如GGG，CCC和ATrich。
（4）错配?尽量避免引物在模板上有错配位点。无法避免错配时，最好不要有产物生成。3‘端尤其不要形成非特异性结合。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
2、设计软件?PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计需要一定的经验，不能单纯依赖软件。?常用软件
PrimerPremier5.0（自动搜索）*
Oligo6（引物评价）
VectorNTISuit
DNAsis
Omiga
DNAstar
Primer3（在线服务）
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