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基因组DNA污染不同引物设计的QPCR
引物设计、基因组DNA污染的QPCR表象和判断：（引物不跨内含子，引物跨内含子，引物跨外显子）
1.内含子（introns）内含子是基因内的间隔序列，不出现在成熟的RNA分子中，在转录后通过加工被切除。大多数真核生物的基因都有内含子。需注意的是，在古细菌中也有内含子。在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。术语内含子也指编码相应RNA内含子的DNA中的区域。大多数真核结构基因中的间插序列（interveningsequence）或不编码序列。它们可以转录，但在基因转录后，由这些间插序列转录的部分（也可用内含子这个术语表示）经加工被从初级转录本中准确除去，才产生有功能的RNA。基因的编码部分称外显子。内含子常比外显子长，且占基因的更大比例。真核基因所含内含子的数目、位置和长度不尽相同，如鸡卵清蛋白基因的外显子被7个内含子隔开，鸡卵伴清蛋白基因有17个内含子，α-珠蛋白基因有2个内含子，卵粘蛋白基因有6个内含子等。又称沉默DNA（silentDNA）。真核基因中的非翻译区，它不被表达于蛋白质分子或成熟的mRNA中。内含子把单个真核基因分成许多不连续的区域。内含子也可见于某些前核基因组，但较为少见，且也有许多调节功能。由核RNA转录产生的为不均一核RNA(hnRNA)含有内含子，经特殊的酶（如ribozyme）作用切去内含子序列，然后剩余的外显子（exon）被连接酶拼接成为成熟的mRNA。但是,还是有少数被切去的内含子可以发挥酶的作用，催化某些反应。
2.外显子(exon)sequenceofagenesDNAthattranscribesintoproteinstructures外显子(英语expressedregion)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。术语外显子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。*简言之，外显子就是指真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列。
设定：
扩增
熔解曲线
RT1+无基因组污染
强
单峰，Tm1
RT2+有基因组污染
强
单峰，Tm1
RT1－无基因组污染
无或很弱
单峰，Tm1
RT2－有基因组污染
中等强度或弱
单峰，Tm1
RT1+扩增曲线正常，熔解曲线Tm正常，RT1－无扩增，无熔解曲线；
RT2+单峰，RT2－单峰，熔解曲线Tm值正常；CT（RT－）越小，说明污染越严重；如果跑电泳，产物长度正常设计长度；
RNA样品中基因组DNA污染的判定
引物不跨内含子
扩增
熔解曲线
RT1+无基因组污染
强
单峰，Tm1
RT2+有基因组污染
强
单峰，Tm1
RT1－无基因组污染
无或很弱
单峰，Tm1
RT2－有基因组污染
中等强度或弱
单峰，Tm1
引物跨内含子
扩增
熔解曲线
RT1+无基因组污染
强
单峰，Tm1
RT2+有基因组污染
强
双峰，Tm1+Tm2
RT1－无基因组污染
无或很弱
无
RT2－有基因组污染
中等强度或弱，CT越小，基因组污染越严重
单峰，Tm2
Tm2Tm1
所以说，引物设计时，如果能跨外显子，是比较好的（但很多时候做不到）；
如果不能跨外显子，则一定要保证样本的质量；
如果要跨内含子设计，尽量多跨几个内含子(也有困难，比较整体QPCR长度要求尽量短的)；
引物跨外显子
扩增
熔解曲线
RT1+无基因组污染
强
单峰，Tm1
RT2+有基因组污染
仅检测CDNA含量，弱表达可能无扩增（上图为弱表达示意图）
无或杂峰
RT1－无基因组污染
无或很弱
无或杂峰
RT2－有基因组污染
无
无或杂峰
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