中药分子鉴定发展中的若干问题探讨

⊙作者：黄璐琦，袁媛，袁庆军，金效华，张伟，钱丹，蒋超

⊙编辑：小余

近二十年间，国内外学者一起致力于运用生物技术对中药进行研究，尤其是分子标记技术在中药鉴定中的应用是目前最令人鼓舞的进展之一。蛇类药材的分子鉴别方法成为《中华人民共和国药典》（年版）收载的第一个中药分子鉴别方法，标志着这一技术已从实验室研究进入广泛应用阶段。与传统中药鉴别方法相比，中药分子鉴别具有准确性高、重现性好等特点，且不受样品形态的限制，原药材、饮片、粉末乃至含有生药原型的中成药（丸剂、散剂等）均可应用，由于其所需检样量少，对珍稀药材及化石标本的鉴定更具应用价值。但随着中药分子鉴别快速发展的同时，也存在一些误区和问题，值得探讨。

一、中药分子鉴定使用原则

随着分子生物技术的高速发展，大量药用动、植物的基因序列已见发表，动植物DNA条形码的开发已成为科研热点之一。这些公共基因资源为各科研领域的发展提供了宝贵的基础，也加速了中药分子鉴定技术的开发与应用。但由于生物进化机制的复杂性，如多倍化现象(如大黄属植物)、基因水平转移(如菟丝子属)、杂交(如独活属、白珠属)、基因渗入、辐射物种形成（如石斛属、龙胆属）和物种谱系分选不完全等，经常造成物种树与基因树不一致，导致DNA条形码序列在一些物种间没有鉴别力。因此，即使药材真伪品来源于不同物种，其DNA条形码序列也可能完全一致，以致会导致错误的鉴别结论。中药分子鉴定的本质是物种的界定，物种的概念有生物学的种和分类学的种，生物学种的界限是生殖隔离，分类学种的界定是根据分类学特征（如形态特征、DNA序列特征等）的差异，在植物中，很多种间没有明显的生殖隔离，出现大量的过渡类型，导致分类学种界定的困难。如何界定某种中药的物种界限和种内变异幅度，是中药分子鉴定的瓶颈问题，分子系统学是解决这一瓶颈问题的有力工具，缺乏分子系统学分析的中药分子鉴定，就好比“盲人摸象”，难免盲目性和片面性，必然是不可靠的。为此提出中药分子鉴定的二步法：首先建立被鉴定中药所在属完全物种取样（包括药用和非药用的种）的分子系统数据库，然后将被鉴定中药在该数据库中进行比对判断其归属。数据库涵盖物种的全面与否决定了该鉴定系统的可靠程度。

另一方面，中药材种类繁多，使用历史悠久，来源复杂；有些药材来自野生，有些药材来自栽培，它们的进化历史不尽相同。加上异地引种和商业贸易的发展，人为改变了居群间、种间的基因流，使药用植物间发生杂交或基因渐渗程度进一步增强，在栽培药用植物中出现了明显的种质混杂情况。因此，某味药材分子鉴别方法的建立不能证明其它药材品种也具备建立分子鉴定方法的条件，需要采取个案分析原则，即针对具体的药材品种进行个案评估，逐步进行推进，在了解和把握品种具体情况前，不应作出中药分子鉴别使用的结论和决定，更不能简单地予以全盘通过或者全盘否定。

在明确药材物种树与基因树一致的前提下，可以选择合适的基因片段进行中药分子鉴别。由于物种的生活型（木本与草本）、物种形成方式（渐进式分化与适应性辐射）等存在极大的多样性，物种间基因的进化速率存在很大的差异。这使得基因标记在某一类群可能分辨率很高而在另一类群却很低，甚至没有分辨度。到目前为止，还没有一个理想基因标记可以分辨所有的植物类群，因此一味地去寻找高分辨率的“万能标记”可能是中药分子鉴定的误区。在中药DNA条形码的选择上一个可行的办法是“分阶层的鉴定体系”，即先在整个植物界确定一个进化速率适中的基因片段作为核心条形码，然后再在科或属级水平寻找高进化速率的基因作为辅助条形码。当前对于陆生植物核心条形码已经达成共识（matK+rbcL或ITS），而在特定类群基于药用植物基因组筛选辅助条形码并建立标准可能是未来中药分子鉴定的发展方向之一。

总之，中药分子鉴别技术应建立在科学、客观的基础上，遵循在一定系统学研究背景，采取个案分析原则建立分阶层的鉴定体系，为中药分子鉴定使用提供依据。

二、中药分子鉴定研究领域中的热点问题

“真伪优劣”是中药鉴定领域的核心问题。就中药分子鉴别而言，其研究的重点应侧重于解决传统鉴别中的难点和热点问题，如多来源药材鉴别、产地鉴别、年限鉴别、成药鉴别等。

1.多来源药材鉴别

受到历史、地理和人为因素的影响及研究手段的限制，长期以来我国中药材存在多来源的现象。版《中国药典》中收载一百四十余种多来源的药材。按一药一名一标准的原则，科学、客观地逐步解决中药材长期存在的同品名来源问题是未来重要的研究方向，也是《中国药典》要求和规定的理想目标。

药材多来源的生物学内涵即亲缘关系相近的近缘种或相近的分类单位。原动植物的分类地位的确定对多来源药材的鉴别有显著作用。现今多来源药材的研究主要集中于同种药材不同来源的主要化学成分及显微鉴别，如淫羊藿研究，分子水平的鉴别研究尚处于起步阶段。解决多来源药材的问题，在结合形态学考察的前提下，针对特定的问题选择合适的分子片段开展多来源药材的分子鉴定。通常使用核基因组ITS序列、叶绿体基因的非编码区序列及线粒体COⅠ基因对植物较低分类阶元及动物物种进行鉴定分类。遵循中医临床用药经验，对常用的多来源药材进行深入研究，基于系统学的鉴定方法与体系，从居群水平搞清楚中药原动植物的分类地位。按照中药分子鉴定使用原则，在分子系统学研究基础上开展多来源药材的分子鉴定，以期对我国常用多来源中药材进行进一步的系统研究与鉴定分类。

2.产地鉴别

药材的质量因其产地不同而存在差异，已成为业界公论。从总体上来看，近现代药材被划分类为川药、广药、云药、贵药、怀药、浙药、关药、北药、西药、南药十大类别。从单一品种来看，按照产地命名的药材种类繁多，如当归可分为岷归、云归、川归、窑归等；菊花可分为亳菊、滁菊、贡菊和杭菊等。随着对“道地药材认证”、“地理标识产品认证”等工作的重视，对产地鉴别标记的开发已成为迫切需要解决的关键技术问题。

除提取传统区域性状鉴别特征外，分子鉴定有望成为产地鉴别的有力工具，主要体现在以下三种手段：

（1）利用分子谱系地理学基本理论，分析不同产地药材单倍型，构建网状进化树，并结合单倍型和进化树筛选可进行产地鉴别的分子标记。

（2）利用遗传学理论，筛选与药材活性成分积累相关的功能基因，通过比较其在不同产地药材功能基因的变异程度差异，筛选可用于进行产地鉴别的分子标记。

（3）利用代谢组学等技术筛选获得产地特征成分标记物（群），利用免疫检测技术制备成分相关抗体（群），并建立免疫检测芯片、试剂盒或检测试纸条。

3.年限鉴别

大多数中药材均为多年生，其有效成分积累随时间变化呈现一定的规律性。药材的质量因生长年限不同而存在差异，其功效也有区别。如生长4年以上的黄芩宿根称”枯芩”，善清上焦肺火，主治肺热咳嗽痰黄；生长2-3年的黄芩称”子芩”，善泻大肠湿热，主治湿热泻痢腹痛。传统认为人参、黄连等部分根及根茎类药材须生长5年以上才能采收，厚朴等须生长15年以上才能采收使用。目前年限鉴别的主要方法是传统性状鉴别，如人参通过芦头形状和芦碗数目来判断年限，依赖于药工的经验，难以实现鉴定方法的定量化、标准化。

分子鉴定有望成为中药材年限鉴定的有力工具。梁加贝等利用端粒酶活性和端粒长度随生长年限变化的规律，建立了不同年限人参的端粒长度鉴别方法，并建立了对应的数学模型。程春松等利用端粒酶切长度分析(TRFs)对不同年限石柱人参及赤芍端粒长度进行了进一步研究，发现石柱人参及赤芍端粒均随生长年限延长而变短，表明平均端粒长度的缩短可作为年限鉴别的依据。解决多年生中药材年限鉴别问题，将理论研究转化为实际应用工具还需要更多深入的工作。

4.成药鉴别

中成药的定性鉴别通常是利用其原料药的形态、组织学特征、化学成分的物理和化学性质等进行鉴别，常用的方法包括性状鉴别、显微鉴别、色谱法、化学定性法、物理常数测定法、升华法、光谱法等。但由于中成药剂型种类繁多，给其原料鉴定工作带来了许多困难。薄层层析法是目前中成药鉴别的常用方法之一，中国药典收录的一些中成药大部分都采用该方法进行定性鉴别，如：复方丹参滴丸、复方鱼腥草片等。然而薄层层析法根据特征性化学成分有无对中成药中原料药材生药基原进行鉴别不够客观、准确，如对含有金银花中成药的鉴别，一般只检测成药中是否含有绿原酸，然而金银花及其混淆品中均含有绿原酸，因此无法判断在中成药中投放的原料药材是金银花还是山银花。另外，显微技术也是中成药鉴别的主要方法之一，但超微粉碎技术的出现使药粉直径常常不足十微米，导致无法使用光学显微技术对中成药进行鉴定。

分子鉴定技术应用于中成药鉴别，不受化学成分的影响，即使没有性状或显微鉴别经验的人员也能够进行中成药鉴别。蒋超等建立了基于位点特异性PCR技术的中成药金银花原料分子鉴别方法，利用该方法可有效检测成药中投放的原料药材是金银花还是其混淆品。崔占虎等利用序列分析技术尝试对中成药中的复杂原料进行鉴定，采用梯度扩增、克隆测序结合生物信息学分析等手段，从市售连翘败毒丸的19种原料中鉴定出其中的10种，为中成药鉴别研究提供的新思路。

三、中药分子鉴别的技术创新

随着中药分子鉴别的快速发展，对其的要求也越来越高。作为传统鉴别技术的有益补充，中药分子鉴别不仅要在实验室中使用，而且被要求进一步运用于野外、药市、药房和生产企业等各个环节。针对这种情况，袁媛等提出了中药分子鉴别现场运用的策略，按照中药分子鉴别的基本步骤，即DNA提取技术、扩增反应、检测和真伪判定，通过开发新方法，并结合已有技术，进行有效的选择、优化、整合，形成“积木式”的模块化技术体系，即针对具体检测对象的实际情况，在各个环节上选择最优技术，从而搭建最适技术体系，用于中药快速、现场鉴别。

中药分子鉴别的发展除了依赖于人们对生命活动认识的逐步加深，还取决于先进仪器和技术在该领域的应用。以核酸扩增为例，核酸扩增可分为目标扩增(靶扩增)、探针扩增和信号扩增3种方法。其中目标扩增包括PCR、反转录PCR、巢式PCR、多重PCR、随机引物PCR、实时荧光定量PCR、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)、转录介导扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)等；探针扩增包括连接酶链反应(LCR)和多重链接依赖探针扩增(MLPA)；信号扩增包括滚环扩增(RCA)、分支DNA(bDNA)和杂交捕获扩增(HCR)等。目前在中药分子鉴定中常用的是PCR技术，但NASBA、LAMP、TMA和SDA等核酸等温扩增技术，由于其检测测的灵敏度和特异性都得到很大提高，因而在炮制品、中成药等分子鉴定中将发挥更强的作用。随着分子生物学、化学等技术的不断发展，中药分子鉴定将向着快速、简便和高度自动化的方向发展。未来基因测序、基因芯片技术、免疫检测技术、荧光标记技术等检测方法将在中药鉴定领域中得到广泛的发展与应用。

中药分子鉴别是一个应用性很强的领域，尽管我们考虑的只是药材的“真伪优劣”，容易只







































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