给你最直观的Illumina测序三部曲2

在上一期中，小锐带大家简单梳理了Illumina测序技术的三个部分——文库制备、簇生成、测序，并结合图片对文库制备过程作了详细描述（点击这儿回顾）。今天，小锐继续给大家介绍一下簇生成过程。

簇生成

DNA簇生成（ClusterGeneration）是在FlowCell上进行的：

首先，制备好的DNA文库变性成单链后与FlowCell上的核酸丛结合；

然后，添加未标记的dNTP和DNA聚合酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。

接下来，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在FlowCell的表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

FlowCell介绍

FlowCell是有2个或8个泳道（Lane）的玻璃芯片，每个泳道的表面随机覆盖了核酸丛（Oligos，P7和P5接头），核酸丛的序列与核酸文库的接头互补。测序试剂流过核酸丛的同时发生测序反应。

仪器介绍

DNA簇生成是在cBot仪器中进行的。

DNA簇生成流程

DNA文库变性

使用NaOH将双链DNA文库变性为单链。

文库变性前，将其稀释至4nM的浓度，并新配置0.2NNaOH溶液。按照测序试剂盒说明书指导，取等体积的4nM文库和0.2NNaOH混合，室温变性5min，然后加入HT1试剂将单链文库稀释至20pM。最后再次稀释至上机浓度。

Note：精确配置0.2NNaOH，以防止文库稀释至20pM时溶液中NaOH含量超过1mM。因为高浓度的NaOH会抑制文库与FlowCell上的核酸丛杂交，从而减少簇生成。

2

模板链杂交

将芯片和单链文库、试剂放进cBot仪器后，单链文库流过FlowCell，文库P7接头序列与FlowCell核酸丛Oligos互补结合。

3

第一链合成

以单链文库为模板，以FlowCell上核酸丛为引物，在聚合酶作用下合成第一链（复制链），该链被固定在FlowCell表面。

4

桥式PCR

合成第一链后，变性、洗去单链文库模板DNA；退火，第一链P5接头段序列与FlowCell上互补Oligos结合，然后以第一链为模板，以与P5接头序列互补的Oligos为引物进行延伸；再次变性，生成两条固定在FlowCell上的单链。以合成的两条单链为模板进行35个循环的桥式PCR，最终每条单链被复制为多个拷贝。

5

线性化处理

用消化酶将FlowCell上与P5端互补的Oligos切断，使其连接的单链DNA断开，然后从FlowCell上洗去，从而保证FlowCell留下的序列都是一致的。

6

阻断末端

用ddNTP阻断末端，封闭DNA链3’-OH，防止在后续测序过程中继续延伸DNA链。阻断的末端包括文库单链末端、FlowCell上与P5端互补的Oligos末端。

7

杂交引物

reads1引物结合到簇内的DNA链上。

成功做到这一步，“主角”Illumina终于要出场了，成千上万的DNA簇即将在测序仪中变成熟悉的ATCG！下一期，小锐将和您分享关键的第三部分——“测序”，敬请期待！

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供稿：周斌

编辑：王丽燕

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