技术文章三个女人一台戏，看常用的

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　PCR（PolymeraseChainReaction）1

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

在实验中我们做PCR最常用的目的就是检测是否存在我们所需要的目的片段。

荧光定量PCR2

在普通PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。或者使用荧光染料SYBR。SYBR可以结合到双链DNA上面，当体系中的模板被扩增时，SYBR可以有效结合到新合成的双链上面，随着PCR的进行，结合的SYBR染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。

探针法原理

荧光染料法原理

RFLP3

RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用RFLP技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。RFLP技术在用于基因型分型研究的同时，同样的可用于在不同环境中微生物多样性的研究。

DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。

在同源的染色体区段的DNA，用限制性内切酶切割，会产生不同的区段，之后用标记好的探针进行杂交，得到的图谱可以显示出各个区段的差异性。

　　　　　　







































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