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转录组文库构建常用方法
一、mRNA文库
对于真核生物而言，通常所说的转录组研究只包括mRNA。目前，针对不同材料，总RNA的抽提有很多商品化的试剂盒可供选择，提取效果都还不错。
如何从总RNA中分离出mRNA是非常关键的一步，针对真核生物mRNA有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴这一特点，设计了相应mRNA纯化试剂盒，原理是利用带有Oligo-dT的探针可以与mRNA的Poly(A)尾结合进行富集。富集的过程比较简单，首先通过热变性打开RNA的二级结构，然后在一定温度下将总RNA与带Oligo-dT的探针进行杂交，用磁珠来回收这些吸附在探针上的、带poly(A)尾巴的mRNA，经过多次洗涤和洗脱后获得mRNA，紧接着是用二价金属离子（Mg2+）溶液进行处理mRNA使其片段化，被打断的这些mRNA片段，再用随机引物进行逆转录。逆转录成（第一链）cDNA后，再合成出第二链（cDNA)。得到的双链的cDNA两端接上“Y”型的接头，到此，标准的测序文库就构建好，可以拿到测序仪上进行测序。
缺点：1.总RNA质量要求非常高，其RIN值一般要在8.0以上，如果总RNA降解的话，Poly(T)探针所能吸附到的都是靠近mRNA的3’端的那些片段，而mRNA的5’端的那些断片，就会大部分地被丢失，测序得到的结果就会有很大的偏向性。
2.要研究lncRNA，不能用此方法建库。原因在于大部分的lncRNA是没有Poly(A)尾巴的，不能用Poly(T)的探针来吸附。
3.原核生物（如细菌）的mRNA通常是没有PolyA结构的，所以不能用Oligo-dT的方法进行富集。
二、链特异性lncRNA文库
在总RNA中，大部分是核糖体RNA（rRNA，95%左右），而rRNA在各物种中是高度保守的，没有太大的研究意义。mRNA、lncRNA以及circRNA的表达量变化情况以及结构上的变异信息是我们研究的重点。
如何去除rRNA呢？目前有专门商品化的试剂盒可以去除核糖体RNA，值得注意是选择适合所研究物种的去除核糖体RNA的试剂盒。原理是基于设计吸附核糖体RNA的探针，用探针来吸附核糖体RNA，再用带链霉亲合素的磁珠来吸附这些带生物素标记的探针，最后磁珠被磁铁吸附在管壁上，而其它的RNA，包括mRNA、LncRNA、和smallRNA等RNA则留在上清液当中，这样我们就去除了物种中的rRNA。
模式生物基因组序列，转录本序列，都是比较清楚的，我们不难知道测到的是正义链，还是反义链，但是对于新物种的转录组测序，我们很难得知。为了解决这个问题，科学家设计了多种方向性文库的建库方法。现在简单地说两种方法，分别是掺U法和Illumina公司的ScriptSeq方法。
掺U法指的用掺入U碱基的办法，来标识cDNA的第二条链。方法：用常规方法从RNA上逆转录出第一链的cDNA，然后，用dUTP来代替了dTTP来合成第二链，接下来，在双链cDNA的两端接上Y型的接头。然后，用USER酶（Uracil-SpecificExcisionReagent）进行消化。（USER酶是一个混合酶，其中的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)能够识别DNA链中的U碱基，并且把U碱基进行糖基化。接着，这个糖基化的U碱基从核酸链上切掉，这样核酸链上就形成了一个缺碱基的空位。接着，混合酶当中的核酸内切酶VIII就在脱碱基位点上把核酸链给切断掉。）这个双链的第二链就会被USER酶切得粉碎，也就是说cDNA的第二链被降解掉了。降解发生之后，双链的文库就只剩下了一条链。而这条链的两头是接的不同序列的接头，接下来进行PCR扩增，得到的文库，保持了模板上的双个不对称的接头序列。测序得到的就是有方向的文库了。
ScriptSeq方法的核心原理：加接头时，左右两侧加不同的接头。起初，在合成第一链cDNA时，用的右侧引物，即带了标签“A”的接头，这样就从这个接头延伸出来的cDNA链右侧就连上了A接头序列。接着，把一个特殊的TTO引物（TermianlTaggingOligo）加进去，此引物的5’端是左侧的标签序列“B”，3’端是一连串随机序列（3’端末尾碱基是一个双脱氧核苷酸，目的是不让这个TTO引物发生延伸反应）其作用是与合成的第一链（cDNA）进行杂交，第一链cDNA就在聚合酶的作用下，进一步延伸。延伸的结果就是把左侧的标签“B”也加到cDNA链上。接下来，再用一对带与标签互补的序列以及与测序芯片上的接头互补的序列PCR引物进行扩增，这样扩增得到的产物，就是正式的文库，测出来就是有方向性的了。
此方法的优点在于保留了RNA方向信息，能更准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现更多的反义转录本，目前被广泛地应用于研究基因结构和基因表达调控等领域范围。
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文案：季红春
编辑：王倩
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