Illumina测序中的化学方法

本文的技术资料，源自Illumina官方公开资料和已发表的论文。详见“原文链接”。

化学方法选择性、定点切断特定DNA链

在Illumina的测序过程中，无论是单端还是双端测序，都会用到特异选择性链切断的过程。其中单端测序的要切断1次，双端测序中的两条链要先后各切断1次（共2次）。

单端测序

时间点，在完成桥式PCR后，把Read1测序引物杂交到模板上之前

目的，需要切断桥式PCR所形成的双链中的一条，只留下单一的模板链，以作为模板，供下面的边合成、边测序之用。

手段，Illumina采用了高碘酸希夫反应。

原理

在合成DNA引物链的时侯，加入一个二醇基团，也就是相邻的两个碳各接一个羟基。

在做完桥式PCR后，用高碘酸钠溶液处理，高碘酸根快速、精确地将二个醇基之间的那个碳碳键切断，从而把不要的那条DNA链从玻璃板上切断。

双端测序

第一次切断

时间点，在是桥式PCR之后

目的，和单端测序中的那次切断的目标一样，是要留下双链中的一条，以作为read1的测序模板

难处在于，因为回头还要利用切断后留下的引物的“茬”来作为接下来长出第二链的扩增引物，又要防止这个茬在read1成为延伸链

手段

Illumina巧妙地利用了“甲酰嘧胺基啶糖苷酶，Fpg”对“8-氧鸟嘌吟糖苷，8-oxo-G”的选择性切断作用

在合成的引物链上加入了一个“8-oxo-G”，这个残基就成了“Fpg”的识别位点

用“Fpg”处理，Fpg就把带“8-oxo-G”基团给切掉，并把那条链给切断，也就是上图的A、B两个步，并留下一带不完整糖基的磷酸基。这个磷酸基在接下来的过程中，起到了阻止链延伸的作用

在后面，要恢复3端羟基的时候，再用“脱嘌呤嘧啶内切核酸酶，AP-endonuclease”把带不完整糖基的那个磷酸基切掉，3端羟基就露出来了。时间点见下面图中的C点

第二条链切断

时间点，在上图的D时间点

目的，要把第二条模板链露出来，进行Read2的测序工作

手段，通过在合成的链中加入一个U碱基，而后在要切断这链链的时侯，用USER酶（UracilSpecificExcisionReagent，尿嘧啶链特定切断试剂）来切一下

可逆终止荧光dNTP

荧光修饰dNTP可逆合成终止，是Illumina测序的最核心技术。

原理

上图就是修饰过的dCTP分子结构式，在核苷酸糖基的3位连一个叠氮基团（红色圈）。这个叠氮基团在链延伸的时侯起到了阻止聚合的作用。

叠氮基团有一个特性，就是遇到巯基试剂（例如：二巯基丙醇），叠氮基团会发生断裂，并在原来的位置留下一个羟基。

在核苷酸的碱基上，也是通过叠氮基团（绿色圈）连接一个荧光基团。4种dNTP分别连4种不同颜色的荧光基团。测序时，通过识别荧光基团的颜色，就可以判断原来的碱基是哪一种。

因为荧光基团与碱基的连接处也是一个叠氮基，所以在用巯基试剂去掉3位阻断的叠氮基团时，会把荧光基团一并切断，并在切断的位置留下一个羟基，而这个羟基正好是碱基原来应该有的。

巯基试剂就这样起到一石二鸟的作用，一方面切掉了3阻断基团，另一方面切掉了荧光基团，使这个荧光基团不会影响下一步的碱基识别。

特别要说明的是巯基试剂切断叠氮基团的效率极高，这可以保证这个反应可以多次反复地高效地进行，而不影响每步反应的得率。在要重复几百次的反应中，每步的得率差一点，最终的结果就会差许多，所谓的指数放大效应。

优点

叠氮基团即起到了可逆终止作用、又起到了连接荧光基团的作用。

巯基试剂可以高效地切断两处叠氮基团，并且在原来的位置留下一个羟基，3端的羟基是下一步的延伸所需，碱基上的羟基是碱基本来就该有的羟基。

缺点

Prephasing

在边合成边测序过程中，每个循环应该合成一个碱基，因为某些原因，会一个循环合成二个或更多的碱基，这种多合成碱基的情况就称为Prephasing。

Prephasing越严重，则测长越短。Prephasing占了Illumina测序长度中几乎一半的限制性因素。

叠氮基团在常温下不是很稳定，尤其是3位的叠氮基脱落，是导致测序时的Prephase的主要原因。

所以Illumina的测序SBS试剂都要低温保存。Illumina的新型测序仪（HiSeq/NextSeq/MiSeq等）的内部还内置了一个小冰箱，来给试剂降温。

Phasing

在边合成边测序过程中，每个循环应该合成一个碱基，因为某些原因，会一个循环没有合成碱基，这种少合成碱基的情况就称为Phasing。

Phasing越严重，则测长越短。Phasing是除Prephasing外的另一个重要长限制因素。（另外还有的两个测长限制因素是：桥式PCR对文库长度的限制、和激光会打断DNA链，本文暂不讨论，以后有机会另文讨论。）

用修饰的dNTP代替天然dNTP来进行边合成边测序的工作，就会遇到天然聚合酶对修饰dNTP的聚合效率低的问题。

为解决这个问题，Illumina用基因工程定向进化的方法不断地改进其测序聚合酶，以提高酶对修饰dNTP的合成效率。现在Illumina的试剂已经改到V4版。Illumina的每次酶改版，都带来测序能力的大幅提升。

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