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PCR引物设计3如何设计嵌套PCR
嵌套PCR又称巢式PCR（nestedPCR,nPCR）,是指以第一次PCR产物为模板直接进行第二次PCR扩增，以增加PCR的灵敏度，第二次PCR设计的引物在第一次所用引物对的内部，这种引物被称为「内部」或「嵌套」引物。
以第一次PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，可明显提高敏感度而对特异性无损（AlbertandFenyo)。
由于嵌套PCR使用两套引物对，在补充反应组分如TagDNA聚合酶后就可能提髙总循环数。如果不能进行完整的嵌套PCR(使用两个内部引物），为提髙灵敏度和特异性，可设计半嵌套PCR，即只用一个内部引物，与来自第一次反应的外部引物结合使用。
嵌套PCR的最大问题是它易受污染。必须将第一次PCR的反应管打开，将初级产物转移到新管，以进行第二次反应。其缺点也包括进行两轮PCR需要额外成本和额外进行引物合成。
为了降低污染风险，可使用一种被称为dropin/dropout嵌套PCR的单管PCR方法。在该方案中，设计的内部引物的解链温度显著低于外部引物对。两对引物都被加于第一次反应中。在首轮PCR过程中，选择只能使外部引物对退火和延伸的退火温度。在第二轮扩增过程中，降低退火温度，使内部引物对能发挥功能。虽然从污染控制的观点考虑该法具有吸引力，但其不能提供最初的嵌套PCR方案的所有优势。
设计策略
PCR引物设计的一般规律对嵌套PCR的引物设计也同样适用。由于使用多对引物，应考虑到引物之间相互作用的可能性明显增大。当设计引物用于单管嵌套PCR时，比较重要的一点是内部（被嵌套）引物的解链温度应显著低于外部（首轮）引物，最简单的办法是缩短被嵌套引物的长度（如18~20个碱基相对于25~28个碱基）。
外部引物对的Tm值应足够髙，以防止内部引物退火，确保在首轮PCR中只产生较长的产物。相对于外部引物，应额外多用内部引物（一般多于40倍）。在进行第二轮PCR时，选择较短的退火和延伸时间，以促进较短的引物退火，提髙较小复制子的产量。
巢式PCR引物设计流程及相关实验教程
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