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经费紧张，蓝瘦香菇目标区域测序帮您解
芯片分型无法解析整个基因组区域？
外显子不包含您关心的区域？
想要高深度测序，奈何区域太大、测序成本太高？
目标区域测序体贴您的心
目标区域测序，即针对特定区域的测序，具备灵活、高性价比的特点，在科研和临床方面的应用越发广泛。
科研应用：随着研究的深入，小样本量已无法满足研究需要，08年一例白血病可以发Science，现在例癌症样品要发同等水平文章难如登天。科研需要大数据，目标区域可以大幅压缩成本。
临床应用：随着测序的普及，科研也在同步地向临床转化。越来越多的目标区域被开发成临床检测的小panel，例如癌症用药检测、疾病风险预测、产前诊断，尤其近年来火热的液体活检。
华大基因拥有成熟的目标区域测序技术，参与发表了不同领域的文章，通过对下列华大发表文章的解读，让小编来带领大家了解下，小区域到底有何大用途？
1，单基因病研究：致病基因明确，可用于临床诊断，低成本更精准
,个健康人基因组数据筛选罕见疾病的抗性个体[1]
期刊：NatureBiotechnology
影响因子：43.
发表日期：.5
发表单位：美国西奈山伊坎医学院，23andMe，华大基因，医院等
摘要：
单基因病的治疗集中在症状减轻，即抑制致病突变的影响。而寻找抗性个体（resilientindividuals即含有致病基因但无疾病临床表型的个体）中的抗性基因是开发这一治疗手段的最佳途径。
文章调取了,个健康人数据（分别来自12项全基因组、外显子、芯片分型项目）进行回顾性研究，寻找拥有致病突变却不发病的抗性个体。研究人员选取了种儿童罕见病相关的个基因，设计筛选panel，逐步过滤，最终找出13个抗性个体。
图1项目设计及流程。（a）来自12项研究的,个健康人数据，进行回顾性研究，寻找抗性个体；（b）设计出致病基因panel，对,个数据进行筛选，其中D、G、M分别代表不同cohort覆盖到panel中的疾病、基因、突变数目；（c）对15,个候选抗性个体，采用逐步筛选过滤的方式，最终确认对致病基因有抗性的13个候选抗性个体（candidateresilientindividuals）。
母体cfDNA目标区域测序用于杜氏肌营养不良产前诊断[2]
期刊：GeneticsinMedicine
影响因子：7.
发表日期：.2
发表单位：医院，华大基因等
摘要：
cfDNA目前已用于21,18,13三体产前诊断，本文拓展了cfDNA诊断的范围，研究cfDNA在杜氏肌营养不良（DMD，OMIM）产前诊断方面的应用。该病是一种X染色体隐性遗传病，男婴患病率为1/-1/，该病70%是由DMD外显子缺失和重复导致的，30%是由DMD的SNP或InDel造成的。
文章招募了8个DMD风险家系，对父母和先证者进行DMD基因目标区域测序分析。分离孕妇cfDNA，进行高深度测序，采用隐马尔科夫模型（hiddenMarkovmodel,HMM）推测胎儿的单体型和基因情况，从而确定患病风险。用羊水穿刺的方法验证，该方法SNP预测准确性平均达到99.98%。
图2项目设计及流程
2，癌症研究：高深度测序，节约测序成本
目标区域测序发现儿童原发性血小板增多症独特的突变特征[3]
期刊：Leukemia
影响因子：10.
发表日期：.7
发表单位：中国医学科学院北京协和医学院，华大基因
摘要：
原发性血小板增多症（Essentialthrombocythemia,ET）在儿童中发病率极低，比成人低倍。ET的biomarker在儿童患者中仅占25.8%，远低于成人（80-90%）。因此需要寻找儿童特有的biomarker，用于临床上诊断区分原发性和反应性血小板增多。
目标区域：根据COSMIC和文献选取55个候选基因，设计上游2k和外显子区域，共计0.35Mb，Agilent探针捕获
策略：样本数25例，测序深度X，目标区域覆盖度99.6%
结果：发现13个基因的体细胞突变（somaticmutations），7个基因的生殖系突变（germlinemutations），说明儿童ET病人突变特征与成人不同，并且更为复杂。
图3突变基因的等位基因频率和对应的病人个数
3，复杂疾病研究：动辄几千甚至几万例的散发样本研究，控制成本才是王道
高深度MHC捕获测序揭露中国银屑病人特有的易感位点[4]
期刊：NatureGenetics
影响因子：31.
发表日期：.7
发表单位：安徽医科大学，华大基因等
摘要：
MHC即HLA，位于6p21.3，与免疫缺陷、自身免疫性疾病、感染、精神类疾病和肿瘤有关。但由于该区域高度的多态性和连锁不平衡，对该区域的研究进展较慢。华大基因联合罗氏公司开发的MHC捕获探针（~5Mb），极大的提高了对该区域的捕获效率和覆盖度。
MHC捕获测序，区域小，数据量仅需1Gbrawdata即可达到分析要求。安徽医科大学和华大基因联合对10,个银屑病患者和9,个健康人进行MHC区域捕获测序，首次构建迄今为止最完整的中国汉族人群MHC遗传变异数据库，再次验证了HLA-C*06:02与银屑病的相关性，同时还发现了许多新的独立的易感位点，例如HLA-C、HLA-B、HLA-DPB1和BTNL2。
图4汉族人群和欧洲人群的HLA等位基因频率对比。研究发现，两个人群MHC等位基因频率差异显著。
动心了吗？看到希望了吗？
华大基因相关服务—目标区域测序原理：利用探针碱基互补的原则，将目标区域片段捕获下来，进行建库测序。常用的平台有：AgilentSureSelect和NimbleGenEZ两种探针试剂盒。
数万例目标区域测序项目经验，大量高水平文章，可以为临床panel（主要是肿瘤）提供从探针设计、优化、个性化分析等多元化服务。
华大基因发表的目标区域测序文章列表
华大基因可提供的目标区域定制化芯片类型
华大基因相关服务—PCR+高通量测序除了目标区域捕获测序外，针对kb的小区域，可以采用PCR+高通量测序的方式来完成。这里主要介绍一下样品量大的情况下，可以采用的平台：Wafergen高通量扩增及建库平台。
Wafergen平台的SmartChip含有5,个well，每个well可以进行单一的PCR反应。基本的流程为：1、PCR引物设计和验证，每对引物包括扩增目的片段的内引物和加测序接头的外引物；2、将样品和引物分装到不同的well中；3、每个well进行单一的PCR反应，反应过程中测序adaptor和index已连接到产物上；4、扩增产物pooling；5、上机测序。
图5Wafergen平台建库及测序流程
平台优势：
1、灵活性：SmartChip可以针对不同的引物个数进行灵活设计，一张芯片最低可做到96对引物-54个样品，最高可做到对引物-12个样品。
每张SmartChip可设计的引物对数及对应的样品数
2、价格低廉：样品量大，区域小的情况下，最低可做到元一个样品；
3、省时省力：无需大量的PCR过程，无需pooling建库，减少PCR产物pooling建库引入的偏差；
4、时间快：建库时间短，仅需三天即可完成建库。
平台劣势：
1、需要反复设计和验证引物，大约需要1个月时间；
2、PCR可能会存在部分位点的随机扩增失败。
参考文献[1]ChenR,ShiL,HakenbergJ,etal.Analysisof,genomesidentifiesindividualsresilienttosevereMendelianchildhooddiseases[J].Naturebiotechnology,.
[2]XuY,LiX,GeH,etal.Haplotype-basedapproachfornoninvasiveprenataltestsofDuchennemusculardystrophyusingcell-freefetalDNAinmaternalplasma[J].GeneticsinMedicine,,17(11):-.
[3]FuR,LiuD,CaoZ,etal.Distinctmolecularabnormalitiesunderlieuniqueclinicalfeaturesofessentialthrombocythemiainchildren[J].Leukemia,.
[4]ZhouF,CaoH,ZuoX,etal.DeepsequencingoftheMHCregionintheChinesepopulationcontributestostudiesof北京专业权威白癜风医院治白癜风最佳医院选择
