您的当前位置：寡趣症 > 临床体现 > 为何转录组测序要测重复与Qpcr验证
为何转录组测序要测重复与Qpcr验证
话说大家有没有想过，为什么现在做转录组一定要测重复呢？还有，转录组测完后为什么还要进行荧光定量验证呢？理论上二代测序应该很准确的呀~
论坛上有位网友就有困惑了：如果我本来单个样品间差异就很大，是靠多次取样来减小误差的，那么应该就没有测重复的必要，多个样本混样应该是比重复更好的方式。但是同样的问题出现了，混样需不需要重复？如果混样也需要重复，那现在测转录组就有很大的浪费啊。
这是个很有意义的讨论，小编在这里贴出比较有代表性的回答作为参考~
hld转录组一定要测重复的原因，与你做其他生物学实验一样，没有重复怎么知道你得到结果的可靠，转录组的重复，是为了验证获得基因的测序的可靠性与差异表达的可靠性。转录组的重复有2种，一是生物学重复，一是技术重复，你说单个样品间差异就很大，这是你的生物学重复不好，那你只做一个转录组，那这样的结果偶然性很大，要尽量选择培养条件一致的样做重复。关于多样品的混样，实际上不需要重复，但是做了最好，混合测序有一定的缺陷，因为混样本生会降低低表达量基因的检测。至于为什么转录组测完后很多都有做荧光定量验证，因为转录组测序是以数学模拟计算表达量，筛选的基因比较多，一定程度上会有误差，而荧光定量与转录组表达是不同的方法，是对特异基因表达量的检测，特异性相对更高。
yuzhe混样在某些研究中是迫不得已采取的方法之一，比如样本太少，比如你这里的单样本间差异较大。这种方法是可以接受的，而且个人认为混样测序再取重复的必要性并不大。这就联系到为什么还要做定量的问题了。即使每个样本差异大，定量也可以通过box图等等展现每个样的真实情况和混起来的整体趋势。
二代测序准确，体现在整体趋势准确，具体到每个基因，准确性没有那么高，如果一个转录本有很多种剪切体，不同的定量引物做出来的结果都不同，也不能说荧光定量不准。同理，测序比对等环节也是有机会出现错误的，所以需要两种方法互相check一下，一个所谓数学方法，一个所谓实验方法，干湿结合。
周老师混样当然也需要测重复。
1.测重复的目的是什么？
任何生物学实验都存在随机误差。重复是用于估算随机误差的大小，然后才能证明组间的差异大于随机误差，生物学处理的效应是存在的。如果不测重复，你怎么能证明处理组间的差异不是仅仅由随机误差导致的？
2.混样是减少随机误差，并不是消灭随机误差。
这个结论在任何一本生物统计书里都有说明。假设单个样本取样的随机误差是V，那么10个样本混样后的随机误差就是V/10。既然是减少，而不是消灭随机误差，所以依然需要通过测定重复来估算混样后的随机误差大小。
3.混样作为重复（但不是不做重复），的确是材料个体遗传差异大，而经费有限的情况下，不错的实验策略。
例如动物实验：3vs3的策略其实很不科学。在重复数有限的情况下，个体巨大的遗传差异导致的随机误差（Ve），完全可能会掩盖处理效应（Vt）。最科学的方法是提高实验样本数，来提高统计检验的自由度（df），从而降低随机误差的干扰，提高统计检验的敏感性。但提高检测样本数，尤其是RNA-seq，成本是个问题。所以，可以通过以混样作为重复，来降低Ve，在不增加成本的情况下，提高检验的敏感性。
举个例子：如果是一种昆虫的RNA-seq实验，由于个体差异太大，3vs3可能检测不到差异基因。但如果30vs30，提高检测的敏感性，当然可以检测到更多差异（尤其是效应微弱的基因）。但这样处理成本太高了。有个补偿的方法可以考虑，多个样本（例如10个）混合，作为一个重复，然后测3个重复。那么生物取样误差就降低到个体取样的10%。测序费用还是6个样本，但整个检测的敏感性却明显提高了。
这个问题，在其他主题帖也有讨论过：
生物学重复到底设定多少个合适
