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检测荧光定量PCR技术四
特异性Taqman水解探针法
Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生。随着扩增产物的增加，荧光增强。PCR扩增程序通常将复性与延伸合二为一。常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX。
TaqManMGB探针
探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non—FluorescentQuencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的探针更容易设计。研究表明，TaqManMGB探针对于富含A／T的模板可以区分得更为理想。
由于Taqman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性，同时它也可以用于多重反应，但探针设计成本较高，有时探针设计困难。
