李曼大会直通车猪瘟的诊断钟明华教

报告人：钟明华/台湾省动物研究所

引语

猪瘟是个非常麻烦的问题，到目前为止，在人为有效的控制下，大规模的疫情不常发生。但是现在猪价是高高低低，低的时候有的老板不怎么注意猪的防疫问题，有的甚至不好好喂料，这种情况易引发猪瘟。发生猪瘟蛮让人担心的是，猪场老板不往上报，偷偷把猪卖掉。甚至有些地区发生猪瘟疫情后，对猪场进行立体诊断有点困难，尤其是在乡下，比较缺乏医药设备等，会更困难。但是必须要加强诊断。首先向大家致歉，我的PPT里都是繁体字，希望不会对大家造成困扰。

今天的内容三个方面，首先是猪瘟及猪瘟病毒的介绍；第二是向大家报告台湾卫生所的猪瘟诊断SOP;第三是猪瘟病毒的区别与鉴定。

目前猪瘟疫苗使用非常普遍。实验室诊断中采用PCR方法进行检测，结果为阳性的可能是疫苗毒，不是野毒，这个时候要小心，不然仅仅根据肉眼和PCR的阳性结果判断，很有可能造成误判，认为这是猪瘟，就会觉得到处是猪瘟，所以猪瘟病毒的区别与鉴定很重要。吴老师也讲过猪瘟是非常厉害的一个病毒，这个病毒会引起临床很高的死亡，但奇怪的是我们在用细胞培养时，没有任何细胞出现变性，感染的细胞照样在分裂，这个很奇怪，所以猪感染后死亡率会高到百分之百。

一、猪瘟及猪瘟病毒

猪瘟只有一个血清型，且猪是唯一一个自然宿主和唯一一个感染来源。猪感染猪瘟后全身带毒，甚至皮屑和毛囊都带毒。更不用说粪便、尿液，带毒量会更多。

猪瘟是RNA病毒，基因全长是bp。有一个血清型，三大基因群，十一个基因型，三个基因库，十一个基因肽。猪瘟病毒会合成几个结构性蛋白，大部分都是非结构性蛋白。要注意的是在结构性蛋白中ERNS、E1、E2是三个是很重要的核糖蛋白，E2是用来做四单位疫苗的，ERNS是用来做区别诊断的。

二、猪瘟诊断流程

这是台湾卫生所里猪瘟诊断的SOP。当接诊到发病的猪，在检查的时候可能会先抽血，看其血象；再临床检查猪的外表有什么样的病变。之后开始解剖，采取一些必要的病变组织，如淋巴，肺脏等组织做病理学检查，这都是必要性的手段。病原学检测非常重要，其中一个是做病理学切片，但是病理这块越来越不受重视，一做检测就是PCR检测，忘记了病理学检测的重要性。病理学检测有几个技术。第一个是荧光抗体染色，这是非常老的技术，操作起来会很麻烦，下面有几张照片，已经没有人做了。除了做病原学检测外细菌分离和抗体检测也很重要。抗体检测目前主要是做监测用的，对疾病诊断不是强项，没有病原检测那么重要。在病原学检测除了冷冻切片，就是做病毒分离，这是绝对必要的，通过病毒分离可以做很多事情。ELISE方法的病原检测也是有的，但不常用。病料采集到后可以做病毒分离，也可以做PT-PCR，如果你的引物够好，做一次PCR就可以确定是不是猪瘟，是疫苗毒还是野毒。PCR之后，最好再进行核酸序列分析，并进行比对。现在我们实验室开发了DNA芯片，DNA芯片可以区分猪瘟是本土毒株还是野外流行的毒株。

猪瘟临床症状

吴老师已讲过很多，我就不再多讲，小猪感染后皮毛粗糙、畏寒等都是猪瘟发烧的症状。

肉眼观察：耳朵皮下出血、发绀，皮肤潮红、皮下点状及斑状出血。

剖检可见肾脏出血、脾脏梗塞、淋巴结肿大、周边出血，胸腺萎缩，结肠、盲肠有溃疡病灶，膀胱点状出血等。

以上都是猪瘟的典型症状，但是现在的疾病很复杂，往往看到的症状不是那么典型，不容易诊断。举例：在九几年的时候，在台湾发现一个叫Teschovirus的病毒，这是一个很古老的病毒。在-年在捷克有一种病叫Teschovirusdisease，为强毒性病原型较强。年，在英国叫Teschovirus，是病原型比较弱，在年左右，在国际一个病毒命名会议上，把这两个病毒命名成一个Teschovirusdisease。

需要注意的是：当肉眼看到淋巴结肿大、周边出血、肾脏有出血点这些症状时，确实这都是猪瘟典型病变；在组织病变中也能看到非化脓性脑炎，这也是猪瘟病变。但假如你看到这些症状，就跟老板说这就是猪瘟，会让老板引起恐慌，会偷偷把猪处理掉，甚至老板会责骂疫苗公司，又骂工人不负责，结果不是猪瘟，就冤枉人了。不只是猪瘟，包括口蹄疫，只靠眼睛去断定，会很危险，所以要请专家来把猪只解剖，把样品送到实验室去做进一步检测，确诊。

三、实验室诊断

这是实验室常见的诊断方法，我会做一个详细的说明。

1、血液学检查

做血液学检查的时候，也许会检测出病毒，也就是病毒血症，会看到抗体的产生。

2、冷冻切片荧光标示抗体染色

在做荧光切片的时候，病料为扁桃腺、脾脏、淋巴、耳尖、舌头、肠管都可以拿来做组织切片。

此照片为SPF猪感染猪瘟病毒第五天，大腿内侧皮肤上做冷冻组织切片，可以看到荧光。

此照片为SPF猪感染猪瘟病毒第五天，扁桃腺腺窝的荧光。

此照片为SPF猪感染猪瘟病毒第九天，耳皮组织的荧光。所以说感染猪瘟后全身都带毒。

3、抗体检测

抗体检测部分，有几个技术可以用，当做中和试验时，你不看到细胞病变，可用间接荧光标示抗体。可能用END方法，ELISA目前是最方便的检测方法，中和实验很麻烦。但如果采用ELISE方法就要找到ELISE方法与中和抗体之间的规律。因为我们事实上就是想知道中和抗体的高低，因为中和抗体是对抗病毒的工具。

4、病毒分离

病毒分离时初代猪睾丸细胞和肾脏传代细胞都可以用，但最好的是用初代细胞，病毒比较容易分离的到，梯度会比较高一点。

做病毒分离需要间接荧光标示抗体和间接过氧化氢酵素标示抗体染色以及RT-PCR方法都可以做病毒鉴定。

(1)间接荧光标记抗体会有荧光，但不易得到这么漂亮的照片，有时只有一个荧光，会怀疑是不是有病毒。

(2)酵素标记抗体染色：能看到细胞质的部分，细胞核比较淡，细胞质比较浓，有时候细胞处理不好，培养不好，细胞会掉，掉的很严重。

(3)RT-PCR目前猪瘟诊断的一个主流技术，不只猪瘟做RT-PCR，好多病都用RT-PCR方法。

但是刚刚提到做PCR检测比较危险，要设定一个很好的引物，引物的特异性和敏感性要够，有了很好的引物即使有少量的病毒都可以检测到，呈现阳性的反应，有了引物RT-PCR检测才能够有效的进行。但要加上基因序列检测才能够区分出是苗毒还是野毒。

如图检测PCR检测结果：样品全部来自猪的不同组织脏器，肺脏等。1-5是野毒，序号6是猪瘟疫苗毒，条带位置是完全不一样的，序号7是野毒，条带位置和序号5一样，所以说你的样品够好够干净，里面的病毒量含量多，大概一次PCR就可以得到答案。如果样品污染严重，病毒含量也不够多，那PCR的敏感性就会降低，检测结果可能会有比较多的假阳性和非特异性。

目前在台湾有3个不同的细胞苗。3个不同的细胞苗都有不同的基因条带。1-5号是野毒，6号是脾淋苗，7是台湾的另外一个细胞苗，8号是自己研发的细胞苗，9号是台湾另外一个细胞苗。

不同LPC疫苗株及野毒猪瘟病毒株核酸系列：KS1-CP1是野毒序列，没有T的差异、LPC-China有12个T的差异、HCLV有12个T的差异是疫苗毒、LPC-TS有27个T的差异、LPC-CN很接近13个T、LPC-PRK是用兔子的肾脏驯化来的细胞苗，有37个T的差异，所以跑一次胶很容易分开。

为什么需要用PCR去诊断鉴定?

1、因为RT-PCR反应太过敏感，假如你的引物设计的不够好，引起非特异性反应，容易混淆，而造成误判。

2、因为从形态学上或肉眼判断很多看起来很类似，这样的情况会增加判断的准确性。

上图是我们卫生实验所开发的基因诊断芯片，这个基因芯片可以分辩出以前流行的猪瘟病毒和目前流行的野毒，可以区分疫苗毒，甚至可以区分BVDV病毒，也可以利用芯片去监测PCV类型一和类型二。PCV类型1普遍存在猪身上，变成一个常在的病毒。

此篇文章为李曼会议钟明华教授分享课题翻译。

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