干货分子诊断常用技术介绍

分子诊断技术即是利用分子生物学方法对人类及病原体的各类遗传物质进行检测，以帮助对疾病进行诊断。以技术原理出发对分子诊断技术进行归类与评价，以对目前临床常用技术的沿革进行回顾。

年Hall建立的液相分子杂交法标志着人类掌握分子生物学技术对特定核酸序列进行检测，开启了对疾病分子诊断的大门。年Mullis提出的聚合酶链反应(PCR)概念，更是给分子诊断技术插上了基因扩增的翅膀，大大提高了基因检测技术的敏感度与特异性，降低了分子诊断的技术门槛。按照检测的原理对半个世纪中临床常用的分子诊断方法进行归类，以分子杂交、核酸序列测定、分子构象变异与定量PCR4大类对其历史沿革、技术原理与实践应用进行简要的介绍与评论，以更好的回顾过去，展望分子诊断领域的未来。

一、基于分子杂交的分子诊断技术

上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年，由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增，人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现，为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。

(一)DNA印迹技术(Southernblot)

Southern于年发明了DNA印迹技术，通过限制性内切酶将DNA片段化，再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离，通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上，再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交，经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交，保证了检测的特异性。因此，一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法，广为运用于各种基因突变，如缺失、插入、易位等，及与限制性酶切片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)的鉴定中。Alwine等于年推出基于转印杂交的Northernblot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。

(二)ASO反向斑点杂交(allele-specificoligonucleotidereversedotblot，ASO-RDB)

使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性，但存在操作极为繁琐，检测时间长的缺点。年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法，构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specificoligonucleotide，ASO)，更使对核酸序列点突变的检测成为可能。年，Saiki首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来，实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测，Saiki又发明了ASO-RDB，通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色，进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上，只需通过1次杂交反应，即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因，具有操作简单、快速的特点，一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。

(三)荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)

FISH源于以核素标记的原位杂交技术，年Rudkin首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪80～90年代，细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术，FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势，可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针，可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。如今，FISH已在染色体核型分析，基因扩增、基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(







































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