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RNA靶向基因编辑寡核苷酸文库新玩法
导读
张锋团队再次改写CRISPR游戏规则，发现C2c2蛋白可以靶向RNA进行编辑。传统Cas9酶进行基因编辑为DNA水平，而C2c2则是首次被证明可以在转录层面进行编辑。CRISPR-C2c2有望成为比RNAi更有前景的一项RNA编辑技术。
1CRISPR-C2c2崭露头角MIT博德研究所的张峰课题组最近发现，CRISPR不仅可以针对基因也就是DNA水平上进行编辑和修饰，还能在转录层面上进行调控。张峰和他的同事们在6月份最新一期的Science上报道一种名为C2c2酶，这种不同于Cas9的新蛋白可以靶向RNA进行基因编辑，并比传统的RNAi也就是RNA干扰有更广阔的应用空间。
CRISPR-C2c2系统能够根据靶向序列特异地编辑单链RNA。C2c2，全称为Class2typeVI-ACRISPR-Caseffector，同家族的Cpf1(18),C2c1,andC2c3并无编辑RNA的功能。年12月，张锋曾经在《分子细胞》(MolecularCell)发文，系统梳理过C2c2等四个核酸酶的功能。
2Cas9酶的相关研究日渐成熟年后，全球有大量的生物学家和生化学家们都将目光锁定在TypeII型CRISPR上，其中的一种酶也就是Cas9被研究的次数较多。而人工合成的一小段singleguideRNA（sgRNA），可以替代细菌体内的crRNA和tracrRNA，和Cas9酶一起对目标区域的DNA进行编辑。
3改造后的Cas9酶功能花样繁多一般对Cas9进行一系列改造后，这种神奇的核酸酶还能行使其他几十种各种各样的功能，如单链裂解、靶向定位等。之后的三年内，关于CRISPR的文献如雨后春笋般大量涌现。随着Cas9、cpf1等各种CRISPR酶的晶体结构被发现解析，人们对于Cas9酶的功能研究和改造从未停息。在这些发现的基础上，科学家们建立了一套成熟的CRISPR实验操作流程体系，从单基因的单位点编辑到全基因层面的大规模基因编辑一用俱全（OligoMix?助力CRISPR研究，可低成本大规模合成高质量的单链寡核苷酸链，也就是pooledgRNAslibrary用于构建CRISPR文库，让科研工作者在基因组层面的大规模编辑变得更加高效快捷）。
4Cas9酶和cpf1酶的相关功能结构域解析传统的II型CRISPR系统中的Cas9酶具有几个关键的结构域，如RuvC和HNH。这两种结构域具有核酸酶的功能，HNH剪切互补链，RuvC剪切非互补链，在基因组上产生双链断裂。这两种结构域构象的改变会直接影响对DNA双链切割活性（如下图所示）。
而cpf1酶体积更小，更容易包装进入慢病毒文库，几乎没有脱靶效应，只需crRNA，也有广阔的应用前景（如下图所示）。韩春雨老师所使用的NgArgo蛋白首次报道使用磷酸化修饰的sDNA在37℃进行基因编辑，虽然在植物中应用前景暂时不明朗，但是在哺乳动物中应用前景却是相当广泛，之后针对NgArgo酶的改造研究也会大量涌现。
5如何玩转C2c2？且看张锋团队如何实现！上述的三种酶都是在DNA层面上进行编辑。令人惊讶的是，新报道的C2c2酶并不没有任何DNA剪切酶的活性，相反C2c2酶含有两种特殊的有别于传统Cas9酶的结构域HEPN（HigherEukaryotesandProkaryotesNucleotide-bindingdomain）。已有研究证明，HEPN具有RNA核酸酶（RNase）的功能，与crRNA一起对RNA进行靶向编辑。但是与CRISPR-Cas9需要crRNA和tracrRNA不同的是，C2c2只需要crRNA即可。也就是说C2c2一种soleeffectorprotein，实现RNA靶向功能。如果将C2c2的HEPN结构域中关键的区域突变掉，会使细菌丧失对噬菌体的抵抗性。体外的生化实验也表明C2c2具有RNA酶活性，而且依赖于HEPN结构域。
该论文的第一作者Omar针对MS2噬菌体基因组设计了大量的crRNAs，设计好的crRNA长度为28个碱基，tiled所有的噬菌体基因组，详见下图。之后使用基因芯片大规模合成包含条ssRNAs的crRNAs文库（联川生物提供相关技术服务，OligoMix?技术可合成高质量的寡核苷酸序列文库）。之后将pooledssRNAs克隆进质粒载体中。通常在其他的CRISPR高通量突变筛选体系中，这些包含ssRNAs的质粒载体在数量上远远不够，试验人员对这些质粒载体进行进一步扩增以大大增加它们的数量。接着这些质粒载体文库也被称作LshC2c2spacerlibrary将会进入大肠杆菌，换句话说他们将C2c2和针对某种RNA的噬菌体特异的间隔序列导入大肠杆菌中。将这些大肠杆菌与MS2噬菌体一起培养16小时后，搜集对MS2噬菌体产生抗性的大肠杆菌，进行二代测序并进入下游分析。
6C2c2潜力无限C2c2的RNA酶的关键位点已经被找到，其引导RNA的结构也可以被设计。这使得C2c2可以被改造成良好的RNA编辑工具。例如，将其酶活性位点突变后，C2c2可以结合特定RNA而不能切割它，这可以使研究人员可以方便地使用荧光标记想要研究的RNA。并且C2c2系统具有高通量的特点，可以更广泛地用于基础研究，并推动对人类复杂性状疾病的发病机制研究。
C2c2这个RNA酶的发现，开拓了CRISPR系统的应用范围。它可以用来标记、修饰、和剪切细胞中的RNA。经过一系列实验，张锋团队证明C2c2可以剪切单链RNA，并且可以直接在细菌活体内做剪切；但C2c2剪切不了双链RNA。
研究人员还发现了C2c2另外一个有趣的特性：当其将靶序列剪切后，它对非靶序列的其它RNA序列也有一定的降解功能。敏锐的研究人员发现了这一点后，认为细菌可能存在不同于CRISPR系统的RNA免疫系统。这是下一步研究的方向和重点。而对于需要精确编辑RNA的工具来说，这个特性未来需要被克服。
基因敲降（geneknockdown）工具当中，目前应用最广泛的是RNA干扰技术。未来该技术有可能被C2c2这类RNA编辑系统取代。C2c2系统具有更高的特异性和敲降效率。它具有两个主要优势：
1.C2c2是一个2元件组成的CRISPR系统，只需要设计起引导作用的RNA序列即可。
2.C2c2基因本身可以被转录和翻译，预示着细胞或细菌中可以做C2c2基因的转基因。
目前CRISPR基因编辑工具越来越完善和齐全了。CRISPR-Cas9对细胞中基因组的遗传改变可以永久性的，而CRISPR-C2c2却可以临时改变相应基因的调控和表达。C2c2系统由于需要28nt的序列做引导，比前者具有更高的特异性；同时，C2c2系统具有更多的基因编辑功能，可以操纵RNA的功能和翻译，也可以用于高通量筛选，制作生物芯片等。
“C2c2是‘CRISPR工具箱’研发中的里程碑”，在麻省理工学院的新闻中，张锋自我评价道，“C2c2的应用前景具有多种可能性，我们很高兴可以为生物医学研究提供这一类工具”。值得期待的是，C2c2这个工具的发现，将有助于生物学家研究RNA在细胞中的精细功能，也有助于人类疾病发病机理的研究。
参考文献1.Abudayyeh,OmarO.,etal.()C2c2isasingle-两味中药治疗肛痔名师开讲nbsp颈椎病症状表现及案例分析案例分析
