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Illumina测序原理终极篇测序
构建好测序文库，再将文库DNA片段成功结合到FlowCell上扩增到成千上万的簇后，illumina测序仪终于该出场了。测序引物将结合到每一个簇上，测序环节将正式启动。在本期，小锐将与大家分享“illumina测序时，是如何保证井然有序的？”、“测序成像过程又是怎样实现的？”等关键信息。
illumina测序三部曲
?文库制备（点击这儿，详细阅读原理）；
?簇生成（点击这儿，详细阅读原理）；
?测序（就是本文咯）。
测序
在FlowCell中依次加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
两项关键技术
可逆终止化学反应技术
测序过程中加入的dNTP是经过特殊修饰的，4种dNTP加入了四种荧光基团标记，并且3’-OH被阻断。这样每添加一种dNTP，与模板结合后只能激发产生一种荧光信号。待机器收集信号后洗除多余的dNTP，恢复3’-OH，去除荧光基团。然后进行下一轮的碱基合成、测序。
▲可逆终止化学反应示意图
测序成像过程
IlluminaHiSeq和MiSeq测序仪器是四通道SBS化学反应，4种DNA碱基中每个碱基发射独一无二的波长强度。每次添加一种碱基dNTP后，激发荧光基团收集荧光信号，洗除残余碱基dNTP后添加另一种碱基dNTP。依次添加4种碱基dNTP，激发、收集荧光信号。在每次循环间，每个簇仅在4个图像中的1个图像出现。
▲四种碱基及其荧光信号举例
▲测序成像示意图
了解测序的基本原理后，
我们再来看一下文库测序流程。
文库测序流程
1Read1测序
杂交Read1测序引物，进行Read1测序；
2
Index测序
杂交Index测序引物，进行Index测序；
3
合成互补链
PairedEndTurnround，合成Read1互补链；
4
Read2测序
杂交Read2测序引物，进行Read2测序。
就在这样的过程中，illumina测序仪“嗖嗖嗖”地给了我们上万条的Reads，给了我们好几G的测序数据，为我们深度挖掘基因秘密提供了技术基础。看起来高深莫测的测序技术，在静下心来细细学习其原理后，就是这么easy！接下来，就该充分利用基因大数据，进行生物信息分析咯~敬请期待锐翌基因更多干货分享~
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供稿：周斌
编辑：王丽燕
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