活着还是死亡，对你的cas9来说，是个大

重磅！科学家利用CRISPR/Cas9首次在非分裂细胞中进行基因编辑！

这一爆炸性新闻再一次惊艳了世人的眼球，捍卫了CRISPR/Cas9的“魔剪”地位。CRISPR/Cas9自问世以来，屡造奇迹，吸引了一波又一波的粉丝。想想如此高大上的CRISPR，我内心便激动不已。不瞒您说，小编我可是CRISPR的迷妹一枚。今天我便和大家一起分享一下如何检测Cas9的活性。

首先，请容许我啰唆几句，概括一下高大上的CRISPR技术。CRISPR技术简而言之就是Cas9蛋白在sgRNA的引导下识别基因组上的特定序列，在PAM上游第三或第四对碱基处进行剪切，然后宿主利用NHEJ或HDR等机制进行自我修复，在这个过程中便会产生碱基缺失或插入，从而导致基因突变或失活。小编认为在这个过程中有三个非常重要的角色：sgRNA、Cas9蛋白和宿主的修复机制。Cas9蛋白是核心，sgRNA是Cas9的眼睛，精准定位剪切位置，而宿主的修复机制最终决定了Cas9是否有有效活性。其中Cas9蛋白和宿主修复机制相对而言比较单一，而sgRNA却是成千上万，在我们讨论检测Cas9是否有活性时，实际上我们是在检测我们设计的sgRNA是否有活性。那么我们该如何来判断Cas9/sgRNA是否有活性呢？目前主要有5种方法：Sanger测序法、错配酶法、限制性内切酶法、荧光素酶SSA法和Cas9蛋白体外酶切法。

一Sanger测序法

不管你进行基因编辑的对象是细胞还是活体，你只要获取编辑后的基因组，便可通过设计引物扩增出你的目的片段，然后将PCR产物或构建TA克隆后进行测序，测序结果与原始未进行编辑的序列（WT）进行比对，你便可知Cas9/sgRNA是否有活性（若为PCR产物测序，则会产生套峰）。

Sanger测序法是最直接最有力的基因编辑结果的证据。但是sgRNA是否有活性本身具有不确定性，若每条sgRNA都进行克隆构建，然后进行细胞实验，甚至是单克隆细胞筛选以及动物实验，最后再提取DNA，进行测序，这样不但实验周期非常长，而且工作量极大，成本很高，得到的结果也不一定都是有活性的sgRNA，易徒劳无功。

二错配酶法

错配酶能够识别不完全配对的DNA并对其进行切割，还能对十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA、异源双链DNA进行识别和切割，主要在错配碱基5’端的第1、第2或第3个磷酸二酯键。如果我们将Cas9/sgRNA编辑后的基因组的靶序列做PCR扩增，然后经过变性，退火，将形成错配。错配酶便能识别错配的杂合双链并且剪切。最后将产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas9/sgRNA的活性。

错配酶法简单易行，灵敏度高，能反映出Cas9/sgRNA基因编辑的效率，有效鉴别其是否有活性，是Cas9/sgRNA活性检测的经典实验。目前市面上的错配酶主要有Surveyor、CruiserTM和T7E1，它们能够检测出大多数的突变类型，但是针对于G/G、C/C、A/A和T/T这几种纯合性错配的检测有一定的限制，而且错配酶法周期长，工作量大。

三限制性内切酶法

限制性内切酶能够特异性识别并切割特定的碱基序列，如果在靶标位置存在限制性酶切位点，通过PCR将目标片段扩增下来，在限制性内切酶的作用下能够被酶切变成小片段，如果酶切位点发生突变则不能被限制性酶识别，不能发生酶切反应。所以若Cas9/sgRNA有活性，则能使酶切位点突变，扩增下来的片段在体外不能被酶切，片段大小大于WT。反之，片段大小与WT相同。

限制性内切酶法与错配酶法原理雷同，但是不需要昂贵的错配酶，节约了成本。由于此法受限于靶序列中是否存在限制性酶切位点，所以使用范围较小。

四荧光素酶SSA法

这种方法的原理是：将终止密码子插入luciferase（GFP）的编码区中央（红色标记），则表达出的截短型luciferase无活性（观察不到荧光）。将sgRNA的靶标序列插入终止密码子后，在Cas9/sgRNA系统的作用下，若Cas9/sgRNA具有活性，则会在靶点位置切割形成DSB，然后，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活性的luciferase（能观察到荧光）。反之若Cas9/sgRNA无活性则仍检测不到luciferase活性（观察不到荧光）。

荧光素酶法操作简单，表型直观。与酶切方法相比，荧光素酶法是利用报告质粒上的基因序列模拟Cas9/sgRNA对目的基因的剪切作用，能够有效筛选具有活性的sgRNA，提高目的实验的基因编辑效率，缩减工作量。但是此法每验证一条sgRNA都需要重新构建一个相应的报告质粒。

五Cas9蛋白体外酶切法

随着Cas9蛋白被克隆，利用Cas9蛋白和体外转录的sgRNA以及目的DNA片段，可以在体外模拟体内反应，验证sgRNA介导的Cas9对目的DNA的切割效率。这种方法相比于前几种方法可以避免构建表达sgRNA的载体以及细胞实验，更为简单方便，也缩短了实验周期，但是是否与细胞检测结果一致却有待进一步考证。

以上，便是小编精心整理的Cas9活性检测的几大方法，再次进行汇总比较，如下表：

最后，小编再告诉您一个消息，吉凯基因在Cas9/sgRNA活性检测上有一套非常成熟的体系，同时采用了经典的错配酶法和Sanger测序法，不仅能有效体现Cas9/sgRNA的编辑效率，并且能得到最终的基因编辑结果。此外，也将推出其他活性检测方法。如果您对Cas9/sgRNA的活性检测或CRISPR其他专题感兴趣，敬请







































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