您的当前位置：寡趣症 > 预防治疗 > 人表皮生长因子受体EGFR突变基因
人表皮生长因子受体EGFR突变基因
人表皮生长因子受体（EGFR）突变基因检测试剂技术审查指导原则-下（征求意见稿）
（四）主要生产工艺及反应体系的研究资料
生产工艺及反应体系的研究资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如临床样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置、Ct（临界）值确定等，提供确切的依据，配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率、离子浓度等关键参数进行有效控制。主要包括以下内容：
1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。
2.反应原理介绍。
3.基因位点选择、方法学特性介绍。
4.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度等。
5.确定PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。如反应体系相同，多个突变基因在相同反应条件下核酸扩增效率是否存在差别。
6.对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。应提供相同反应条件下，多个基因类型是否Ct相同。
7.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。
8.如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。
（五）分析性能评估资料
分析性能评估是反映产品主要原材料选择，生产工艺及反应体系等多方面因素设置是否合理的客观评价指标。检测试剂性能的研究方案应结合产品的反应原理，临床用途，使用条件等综合因素进行设计。性能研究应涵盖产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。
1.病理组织学样本类型
1.1最低检测限
组织学最低检测限样本类型应包括扩增反应终体系中的突变序列百分率和申报产品反应体系中总核酸浓度两个因素。
对于常见基因突变类型建议采用EGFR基因突变型的非小细胞肺癌（NSCLC）中性福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）和EGFR野生型的NSCLCFFPE样本制备DNA存储液；对于罕见基因突变类型，建议采用细胞株或人工合成样本如：EGFR细胞株或质粒与EGFR野生型NSCLCFFPE样本样本制备DNA存储液。同时，还应设置几种常见多突变类型与EGFR野生型NSCLCFFPET样本制备DNA存储液。
EGFR基因突变类型不同比例混合应注意事项；每种基因突变类型样本储存液按照不同突变序列所占比例进行混合，鉴于PCR核酸原理检测灵敏度，此处主要针对EGFR基因突变类型低比例情况进行配比，如从10%或8%起始按不同比例混合。至少包括目标检测限，和检测限上下至少各2个梯度比例范围研究资料，对于按不同比例混合后的不同样本，检测不同样本的实际混合比例并说明检测方法，并以实际混合比例做为下一步EGFR基因突变的最低灵敏度研究。同时，在EFGR基因突变不同比例研究过程中应设置EGFR野生型样本作为空白对照。
确定反应体系总样本加样量以及反应体系中需要的DNA总浓度，申请人需说明每uL的DNA加样量和总DNA浓度确定方法。在进行混合稀释时，使用的FFPE样本应与原混合配置样本类型相同。建议申请人设计一个显著高于反应体系最高DNA加样量的DNA存储浓度。在实际的EGFR不同基因突变比例下，进行不同梯度DNA浓度的检测，不同DNA浓度各检测至少3次，不同梯度DNA浓度范围应涵盖申报产品反应体系中设定的最高DNA浓度和最低DNA浓度。待确定组织中最低检出限后，在组织LOD水平附近额外检测20份平行样本，确定95%置信区间阳性检出率的最低DNA浓度。申请人可用表格形式列明（如表2）
表2最低检测限验证
基因突变类型
所检测批次检出率
实际检测突变细胞比例
总DNA浓度/反应体系
检测次数
突变比例A
DNA浓度a
DNA浓度b
DNA浓度c
以此类推
突变比例B
DNA浓度a
DNA浓度b
DNA浓度c
以此类推
突变比例C
DNA浓度a
DNA浓度b
DNA浓度c
以此类推
以此类推
DNA浓度a
DNA浓度b
DNA浓度c
以此类推
突变比例0
DNA浓度0
1.1.1如申报产品存在不同的核酸提取方法，每种核酸提取方法应配套检测试剂进行各基因突变类型最低检测限验证。
1.1.2如申报产品存在不同适用机型，每种适用机型应配套检测试剂进行各基因突变类型最低检测限验证。
1.1.3组织切片的提取方法应与说明书一致，如申报产品适用于多种组织切片制作方法，最低检测限应对每种组织切片制作方法进行验证。
1.2分析特异性
1.2.1交叉反应
该类产品主要与肺部肿瘤存在较强关联性，申请人在设计交叉反应研究时应将此点纳入考虑。
1.2.1.1核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反应的野生型或其他突变类型序列间交叉反应。EGFR不同基因之间是否存在交叉反应；EGFR家族之间是否存在交叉反应；如多个不同基因联合检测试剂，应检测不同基因序列之间是否存在交叉反应；如：人EGFR/K-ras突变基因联合检测试剂盒（荧光PCR法），需检测EGFR和K-ras之间是否存在交叉反应。野生型人DNA，如不同浓度的野生型DNA核酸样本；非人类组基因验证：如大肠杆菌，真核微生物（酵母菌）等；肺相关感染微生物验证：结核分支杆菌，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌
1.2.1.2申请人需检测表3中列出具有潜在交叉反应的病毒体和人基因序列。病原体需在有临床意义相关浓度检测，细菌浓度水平建议至少cfu/ml，病毒浓度水平建议至少cfu/ml。需明确进行交叉反应病毒或细菌类型及滴度。人野生型DNA至少包含ng/ul野生型核酸样本，应提供所有用于交叉反应验证的突变或野生型序列来源、序列确认和浓度选择等试验资料。有关交叉反应验证的信息应在产品说明书的项中有所体现。
表3潜在交叉反应研究
EGFR不同突变基因型
肺炎链球菌
野生型DNA
流感嗜血杆菌
大肠杆菌
HER-2
酵母菌
HER-3
结核分支杆菌
HER-4
...
1.2.2干扰物质
1.2.2.1申请人应根据试剂盒所采用的样本类型，确定潜在的干扰物质。
常见治疗药物，样本穿刺过程的缓冲液，处理液等，组织处理过程中的缓冲液。（见表4）
1.2.2.2用于干扰试验的样本，靶基因浓度应至少包含弱阳性，而不应仅选择强阳性样本，使用医学相关水平的干扰物质进行验证。此外，建议申请人同时在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下同样进行评价。
表4潜在干扰物研究
甘油三酯
乙醇
血红蛋白
二甲基亚砜（DMSO）
福尔马林
焦炭酸二乙酯（DEPC）
石蜡
沙丁胺醇（albuterol）
二甲基
异丙托溴铵（Ipratropium）
蛋白酶K
氟替卡松（Fluticasone）
亚胺培南（Imipenem）
头孢他啶（Ceftazidime）
氧哌嗪青霉素（piperacillin）
聚维酮碘溶液（Betadine）
三唑巴坦（tazobactam）
利多卡因（lidocaine）
...
1.3精密度
申请人应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。具体实验方法可以参考国际或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。
1.3.1对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂（包括核酸分离/纯化组分）本身的影响外，还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。
1.3.2合理的精密度评价周期，例如：为期至少12天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
1.3.3用于精密度评价的参考品应至少包括弱阳性参考品和高浓度参考品3个水平，如有必要，建议同时设置阴性参考品进行验证，要求如下:
1.3.3.1阴性参考品：待测靶核酸浓度低于最低检测限或为零浓度，建议选用背景值较高的阴性样本，阴性符合率应为%（n≥20）。
1.3.3.2弱阳性参考品：待测靶核酸浓度略高于试剂盒的最低检测限，阳性检出率应达到%（n≥20）。（弱阳性参考品需包括所有的突变位点，如果待测物靶核酸为RNA，则弱阳性精密度参考品中应至少部分典型突变位点的原料为RNA，如RNA干粉或相应的假病毒）
1.3.3.3高浓度参考品：待测靶核酸呈中到强阳性的浓度，阳性检出率为%且CV≤15%（n≥20）。（如果试剂盒可以覆盖多个突变位点的检测，该参考品可以设置为对全部突变位点进行精密度验证，也可以选择其中部分突变位点进行验证，但应至少包含常见突变序列或理论上较难测得的突变序列）
1.4阳性/阴性参考品符合率
各水平、各突变位点的阳性参考品均应按要求检出阳性，考虑到浓度梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应Ct值的限制；阴性参考品在各个引物探针组合的检测条件下均应检出为阴性；如有野生型参考品的设置，在其相应的引物探针组合下检测应为阳性。
1.5样本的稳定性
1.5.1样本提取前核酸序列的稳定性
对于经福尔马林石蜡包埋组织切片样本，申请人应对组织样本保存温度，保存年限进行限定。应规定组织切片的厚度，制作方法，对经临床机构确定的组织切片进行提取。验证不同时间段保存的组织样本对检测结果的影响；
对于新鲜冰冻切片样本，应限定新鲜冰冻切片样本检测时限；新鲜冰冻切片的切片要求。
1.5.2样本核酸提取评价要求
申报试剂配套样本处理试剂的重复性，对同一NSCLCFFPET组织样本中段部分平行切去10份切片样本，设置评价方案，评价指标，评价样本核酸提取过程的重复性。
样本核酸的分离/纯化主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，样本核酸分离/纯化是决定后续核酸扩增过程成败的要素之一。石蜡包埋组织样本在福尔马林固定过程中，会使样品中的核酸与核酸之间，核酸与蛋白之间发生交联；由于不同组织蛋白种类和含量存在差异，不同组织核酸提取试剂可能也有所不同。因此，无论申报产品是否含有核酸分离/纯化的组分，申请人都应对核酸分离/纯化环节做充分的验证。除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。常见的核酸分离纯化均有其优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择核酸分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料。
1.5.3样本提取后核酸序列的稳定性。
样本提取后核酸序列的稳定性。应检测核酸的含量，设置反应体系需要的核酸含量上限和下限。如反应体系中起始DNA浓度过高，可能导致反应体系发生非特异性扩增，产生假阳性结果。如反应体系中起始DNA浓度过低，可能导致反应体系无靶序列扩增反应，产生假阳性结果。紫外-可见分光光度计对DNA浓度进行定量，nm/nm处的吸光度比值（OD/OD）或通过其他方法评价其纯度。设置反应体系所需初始DNA浓度范围，如单位体积DNA浓度超过所需浓度上限或下限，应提供相应的改进措施。同时，应对核酸提取物的保存时间，保存温度进行验证。并评价冻融次数，储存条件等对样本提取后核酸序列稳定性的影响。
1.5.4样本完整性
在样本提取前和提取过程、提取后，以及在储存期间，核酸会发生不同程度地降解。为使降解降低到最低程度（提取前或提取后），应避免样品的多次冷冻/融化。必要时，申请人应评价提取前，提取后冻融次数，储存条件等因素。在长时间储存后，应在使用前评价核酸的完整性。比较检测结果与储存前检测结果的一致性，可采用琼脂糖凝胶电泳或者内参基因PCR检测等方法。
2.外周血类型评价要求
2.1最低检测限
EGFR基因片段在外周血中含量较低且片段较短，易于降解。在评价该部分最低检出限时，建议将拟定量的EGFR阳性基因突变扩增产物或细胞系放入确定体积血浆中，并说明EGFR阳性基因突变定量的方法。然后逐步稀释，每个稀释浓度重复检测至少3次，待确定外周血中最低检出限后，在外周血LOD水平附近再额外检测至少20份平行样本，确定95%置信区间阳性检出率最低DNA浓度。申请人可设置一个基础浓度范围，如从50pg/ul浓度进行稀释，至少包括目标检测限，和检测限上下至少各2个梯度比例范围研究资料，应对本试剂可检测的所有基因型别按照上述方法验证最低检测限。申请人同时需说明总DNA浓度确定方法。最低检出限设置比例应至少验证到1%。申请人可用表格形式列明（如表5）
表5最低检测限验证
基因突变型别
所检测批次检出率
实际检测突变细胞比例
总DNA浓度/反应体系
检测次数
突变比例A
DNA浓度a
DNA浓度b
DNA浓度c
以此类推
突变比例B
DNA浓度a
DNA浓度b
DNA浓度c
以此类推
突变比例C
DNA浓度a
DNA浓度b
DNA浓度c
以此类推
以此类推
DNA浓度a
DNA浓度b
DNA浓度c
以此类推
突变比例0
DNA浓度0
2.1.1如申报产品存在不同核酸提取方法，每种核酸提取方法应配套检测试剂进行各基因突变型别最低检测限验证。
2.1.2如申报产品存在不同适用机型，每种适用机型应配套检测试剂进行各基因型最低检测限验证。
2.1.3如申报产品同时存在不同外周血采血管、采集方法或保存方法，每种外周血采集方法或保存方法应配套检测试剂进行各基因型最低检测限验证。
2.2分析特异性
2.2.1交叉反应
该类产品主要与肺部肿瘤存在较强关联性，申请试剂在设计交叉反应研究时因将此点纳入考虑，如用于其他肿瘤部位还需检测潜在交叉反应物。
2.2.1.1核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反应的野生型或其他突变型别序列间交叉反应。EGFR不同基因之间是否存在交叉反应；EGFR家族之间是否存在交叉反应；如多个不同基因联合检测试剂，应检测不同基因序列之间是否存在交叉反应；如：人EGFR/K-ras突变基因联合检测试剂盒（荧光PCR法），需检测EGFR和K-ras之间是否存在交叉反应。野生型人DNA，如不同浓度的野生型DNA核酸样本；非人类组基因验证：如大肠杆菌，真核微生物（酵母菌）等；肺相关感染微生物验证：结核分支杆菌，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等。
2.2.2.2申请人需检测表6中列出具有潜在交叉反应病毒体和人基因序列。病原体需在有临床意义相关浓度检测，细菌浓度水平建议至少cfu/ml，病毒浓度水平建议至少cfu/ml。需明确进行交叉反应病毒或细菌类型及滴度。人野生型DNA至少包含ng/ul野生型核酸样本，应提供所有用于交叉反应验证的突变或野生型序列来源、序列确认和浓度选择等试验资料。有关交叉反应验证的信息应在产品说明书的项中有所体现。
表6潜在交叉反应研究
EGFR基因不同突变型别
肺炎链球菌
野生型DNA
流感嗜血杆菌
大肠杆菌
HER-2
酵母菌
HER-3
结核分支杆菌
HER-4
...
2.2.2.3干扰物质
用于干扰试验的样本，靶基因浓度应至少包含弱阳性，而不应仅选择强阳性样本，使用医学相关水平的干扰物质进行验证。此外，建议申请人同时在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下同样进行评价。（见表7）
2.2.2.4有关干扰物质的研究结果亦应总结于产品说明书的项下。
表7潜在干扰物研究
血红蛋白
人基因组DNA
红细胞
柠檬酸钠
白细胞
EDTA
血小板
白蛋白
中性粒细胞
甘油三脂
单核细胞
肝素
淋巴细胞
铁蛋白
白蛋白
葡萄糖
HLA抗原
人类精子DNA
多西紫杉醇
柠檬酸钠
吉西他滨
顺铂
紫杉醇
异长春花碱
单核细胞
卡铂
。。。。
2.3精密度
申请人应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。具体实验方法可以参考国际或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。
2.3.1对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂（包括核酸分离/纯化组分）本身的影响外，还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。
2.3.2合理的精密度评价周期，例如：为期至少12天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
2.3.3用于精密度评价的参考品建议设置精密度验证参考盘，应至少包括健康献血源样本，弱阳性参考品和高浓度参考品，要求如下:
2.3.3.1阴性参考品：选择至少3份不同来源健康人群血液作为阴性参考品献血源，待测靶核酸浓度低于最低检测限或为零浓度，计算总的测试次数，评价总的阴性符合率。
2.3.3.2弱阳性参考品：同一临床肺癌基因突变阳性样本检测待测靶核酸浓度略高于试剂盒（计算总的测试位点），弱阳性参考品需包括所有的突变位点。
2.3.3.3高浓度参考品：待测靶核酸呈中到强阳性的浓度，阳性检出率为%且CV≤5%。（如果试剂盒可以覆盖多个突变位点的检测，该参考品可以设置为对全部突变位点进行精密度验证，也可以选择其中部分突变位点进行验证，但应至少包含常见突变序列或理论上较难测得的突变序列）
2.4阳性/阴性参考品符合率
各水平、各突变位点的阳性参考品均应按要求检出阳性，考虑到浓度梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应Ct值的限制；阴性参考品在各个引物探针组合的检测条件下均应检出为阴性；在其相应的引物探针组合下检测应为阳性。
2.5样本的稳定性
2.5.1样本提取前核酸序列的稳定性
外周血采集后，应规定外周血存放条件以及存放时限及温度设置等进行验证，包括采用加入抗核酸降解或防细胞裂解的采血管要求。采样所用的防腐剂、抗凝剂、保护剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。血液通常需要先进行抗凝保存，抗凝剂的选择很重要。申请人需对抗凝剂、防腐剂、保护剂等成分进行验证。
对于外周血样本，因晚期肺癌患者外周血样本中EGFR含量相对较少，基因片段较短，半衰期短。建议明确最少的外周血提取总量，必要时可以增加外周血提取总量。从而保证外周血中EGFR基因片段被提取的机率增大。同时，应保证核酸提取工艺，减少核酸损耗和降解。申请人应对外周血全血保存时间及温度，离心参数设置等进行验证。
外周血样本在满足上述要求外，还应注意全血中血浆和血清均能分离出ctDNA，但通过和相匹配的血清样本比较，血浆中ctDNA有更高的检出率。血浆ctDNA通常片段较短，且在血液中浓度非常低。抽血后延迟血浆分离会导致血细胞裂解，释放出基因组DNA（gDNA）至血浆中；大量增加的gDNA会稀释肿瘤来源的ctDNA，使得突变难以检出。因此在标本的采集、运输及储存过程中，防止游离DNA的降解是首要考虑的因素；其次，也应防止血液中白细胞的裂解，避免因野生型DNA的增加导致ctDNA中的EGFR基因突变无法检测。
因ctDNA含量低，为提高EGFR基因突变检出率，在临床允许的情况下推荐增加血浆用量，为采集到最佳血浆标本用于后续提取游离DNA进行EGFR基因突变检测，推荐在采血管中加入保护剂，如：游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂等。全血采集后建议尽快离心，分离出不含细胞成分的血浆。
2.5.2核酸提取评价要求
样本核酸的分离/纯化主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物。样本核酸分离/纯化是决定后续核酸扩增过程成败的要素之一。一般而言，相对与单一靶序列的检测，多基因序列检测对样本核酸的量和质量更为敏感，核酸提取步骤对于成功获得结果至关重要。应确保具有满足检测反应体系的数量和质量核酸用于检测。不同提取方法产出的核酸的量和质量不同（如：分子量，纯度，单链/双链，PH值变化）。如有多种不同的提取方法和样品基质被推荐用于检测，应确保同一反应体系中不同基因片段和对照品的提取效率相近。因此，无论申报产品是否含有核酸分离/纯化的组分，申请人都应对核酸分离/纯化环节做充分的验证。除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。常见的核酸分离纯化均有其优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择核酸分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料。
2.5.3样本提取后核酸序列的稳定性
样本提取后核酸序列的稳定性。应检测核酸的含量，设置反应体系需要的核酸含量上限和下限。如反应体系中起始DNA浓度过高，可能导致反应体系发生非特异性扩增，产生假阳性结果。如反应体系中起始DNA浓度过低，可能导致反应体系无靶序列扩增反应，产生假阳性结果。紫外-可见分光光度计对DNA浓度进行定量，nm/nm处的吸光度比值（OD/OD）或通过其他方法评价其纯度。设置反应体系所需初始DNA含量范围，如单位体积DNA浓度超过所需浓度上限或下限，应提供相应的改进措施。同时，应对核酸提取物的保存时间，保存温度进行验证。
2.5.4样本完整性
在样本提取前和提取过程、提取后，以及在储存期间，核酸会发生不同程度地降解。为使降解降低到最低程度（提取前或提取后），应避免样品的多次冷冻/融化。必要时，申请人应评价提取前，提取后冻融次数，储存条件等因素。在长时间储存后，应在使用前评价核酸的完整性。比较检测结果与储存前检测结果的一致性，采用琼脂糖凝胶电泳或者内参基因PCR检测等。
（六）阳性判断值确定资料
研究人员在设定申报试剂阴性/阳性等结果cut-off值被确定依据。包括制定研究方案、设定评价标准、分析研究数据等。提供cut-off值研究方案，研究过程以及研究原始数据等。例如：人群流行学信息，疾病类型等。应列举cut-off值计算过程中采用的所有统计学方法。如果试剂存在灰区，应解释说明如何确定灰区范围。并明确临界值在不同的样本类型是否有差异。用试剂在独立样本人群中对研究拟确定的cut-off值进行充分验证。
（七）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及申报试剂的稳定性。主要包括效期稳定性（有效期）、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于效期稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
（八）临床评价资料
申请人应在符合要求的临床机构，在满足临床试验最低样本量要求的前提下，根据产品临床预期用途、相关疾病的流行率和统计学要求，制定能够证明其临床性能的临床试验方案，同时最大限度地控制试验误差、提高试验质量并对试验结果进行科学合理的分析。
1.临床试验方案
临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报机构的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
方案中临床样本信息应明确以下信息：采集时间要求；标本类型；采集量；采样质量的要求；该类要求应与产品说明书中规定的要求一致，如产品说明书中未列明，应在临床方案中进行列明。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究机构选用的参比试剂应完全一致，以便进行合理的统计学分析。临床方案中还应明确复核试剂及方法。另外，考核试剂适用的样本类型、可检测的基因突变类型不应超越参比试剂的相应检测要求，若此种情况发生，则应选择其他合理参比方法对额外的样本类型和基因突变类型进行验证。一般应当包括以下内容：
1.1一般信息；
1.2临床试验的背景资料；
1.3试验目的；
1.4试验设计；
1.5评价方法；
1.6统计方法；
1.7对临床试验方案修正的规定；
1.8临床试验涉及的伦理问题和说明以及《知情同意书》文本；
1.9数据处理与记录保存。
2.临床试验必须符合赫尔辛基宣言的伦理学准则,必须获得临床试验机构伦理委员会的同意。研究者应考虑临床试验用样本的获得或试验结果对受试者的风险性，应提交伦理委员会的审查意见及受试者的知情同意书。对于例外情况，如客观上不可能获得受试者的知情同意或该临床试验对受试者几乎没有风险，可经伦理委员会审查和批准后免于受试者的知情同意。
3.临床研究机构的选择
建议申请人在选择临床机构时，应在国内不同区域选择临床机构，尽量使各机构的临床样本有一定的区域代表性；临床研究机构进行EGFR基因突变检测应须建立PCR标准实验室，获得相关资质认证；同时需要有实验室质量管理体系以确保检测结果的准确性。工作人员应接受过PCR上岗培训，且技能熟练。检测者必须是接受过良好培训的技术人员，实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和参比方法都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
4.NSCLC组织类样本设置
4.1对比方法选择
4.1.1如选择已有同类上市产品，其临床研究可以选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，同时应充分了解产品方法学，临床预期用途，主要性能指标，阳性判断值，突变基因位点选择等，以便对试验结果进行科学分析。采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，至少证明本品与已上市产品等效。但应充分考虑已上市同类试剂应具有相同的突变位点且对比试剂检测结果可以区分每个突变型别等特性，确保考核试剂与申报试剂具有明确可比性。
4.1.2如选择核酸序列测定方法作为此类试剂临床试验研究的对比方法，验证考核试剂检测结果与核酸序列测定（测序）结果之间的一致性情况。临床研究报告中应对选用的测序方法作详细介绍。
申请人应提供以下关于测序部分的详细试验资料，需有临床试验机构签章确认。
4.1.2.1测序方法原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。
4.1.2.2测序方法所用引物相关信息，如基因区段选择，分子量、纯度、功能性实验等资料。引物设计应合理涵盖考核试剂扩增的靶核酸区段、位点、及所有突变型别。
4.1.2.3对所选测序方法的分析性能进行合理验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与申报试剂的相关性能进行适当比对分析。
4.1.2.4测序方法应建立合理的阳性质控品和阴性质控品对临床样本的检测结果进行质量控制。
4.1.2.5提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。
4.2病例选择
临床试验应以非小细胞肺癌肿瘤患者为主要研究对象，其中应涵盖注册申报试剂所声称的所有基因型且每种突变型别均应有一定量的阳性病例。对于阴性病例的选择，也应考虑到交叉反应验证的需要，以从临床角度考察其分析特异性。若产品适用于多种样本类型，则应对所有样本类型均进行临床验证。具体要求如下：
4.2.1临床试验所需样本总例数不少于0例，临床样本类型应以肺腺癌为主，还应包括一定数量的其他类型肺癌及肺部相关良性疾病。
4.2.2组织学样本
在满足福尔马林石蜡包埋切片组织样本不少于0例的情况下，如样本类型适用于冰冻新鲜样本，应完成不少于例冰冻新鲜样本。
4.2.3如申报试剂中包括不同的样本提取方法，每种方法做不少于例同源性临床对比研究。
4.2.4EGFR新基因突变型别临床研究
依据现有EGFR个体化临床研究结论，EGFR与个体化用药的主要突变型别已被证实具有临床意义且已有同类产品批准上市；因EGFR突变基因在不同种族中人群易感性不同，在亚裔人群中发生率明显高于高加索人群，申请人在申报新的EGFR突变基因位点时，因考虑EGFR突变位点在不同人群中的差异。对于EGFR基因突变检测未在中国批准上市的新基因突变型别，在注册申报时，应提供突变类别在我国人群中的突变比例以及与分子靶向药物的关联性临床研究资料，资料中需明确新的EGFR基因突变型别与靶向药物的明确关联。
4.3统计学分析
对于本类产品对比实验的等效性研究，对临床试验结果统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、阴性/阳性符合率、阳性预测值、阴性预测值、kappa检验的形式总结不同对比方法的定性检测结果。统计分析应可以证明不同方法的检测结果有无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，设置a值及P值假设条件，即评价申报试剂与参比试剂是否等效的标准。
4.3.1建议采用四格表对申报试剂和对比方法学统计分析。如表8
4.3.2统计每个突变类别阳性符合率和在所有阳性病例中所占比列。如表9
表8每种EGFR基因突变型别阳性四格表分析
对比方法学
申报试剂
阳性
阴性
阳性
A
B
阴性
C
D
临床灵敏度=A/(A+C)
临床特异性=D/(B+D)
阳性预测值=A/(A+B)
阴性预测值=D/(C+D)
表9每种EGFR基因突变型别阳性率统计
试剂盒不同基因型
阳性样本例数
在所有阳性样本中所占比例（%）
在所有临床样本中所占比例（%）
TM
LR
...
4.3.3对本次临床研究中人群基本特征进行分析，例如：年龄，性别，疾病类型等建议进行统计分析，如表10
表10人群基本特征统计表
因素
所占总数比例
考核试剂
对比方法
性别
男性
女性
年龄
50岁以下
50-59岁
60-69岁
69岁以上
疾病类型
肺腺癌
肺鳞癌
腺鳞癌
大细胞癌
...
癌症分期
I
II
IIIa
IIIb
IV
5.外周血样本类型具体要求
5.1对比方法学选择
5.1.1如选择已有同类上市产品，其临床研究可以选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，同时应充分了解产品方法学，临床预期用途，主要性能指标，阳性判断值，突变基因位点选择等，以便对试验结果进行科学分析。采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。但应充分考虑已上市同类试剂应具有相同的突变位点且对比试剂检测结果可以区分每个突变型别等特性，确保考核试剂与申报试剂具有明确可比性。
5.1.2如选择核酸序列测定方法作为此类试剂临床试验研究的对比方法，验证考核试剂检测结果与核酸序列测定（测序）结果之间的一致性情况。临床研究报告中应对选用的测序方法作详细介绍（该项要求请参照4.1.2.1项至4.1.2.5项）。
5.1.3因外周血中EGFR片段较短、含量较低，而直接核酸序列测定方法如Sanger法最低灵敏度检出限通常低于核酸扩增检测方法学，故在外周血检测EGFR基因片段中可以采用高通量核酸序列测定方法作为此类试剂临床试验研究的对比方法，验证考核试剂检测结果与核酸序列测定（测序）结果之间的一致性情况。临床研究报告中应对选用的测序方法作详细介绍。申请人应提供以下关于测序部分的详细试验资料，需有临床试验机构签章确认。
5.1.1.1测序方法原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。
5.1.1.2测序文库构建组分的主要组成、原理介绍。
5.1.1.3数据库（参考序列）类型、数据库的溯源信息、完整性等信息。
5.1.1.4生物信息学分析软件，数据存储中心，异常情况处置方案等信息。
5.1.1.5测序方法所用引物、探针、接头、连接酶、聚合酶、逆转录酶及限制性内切酶相关信息，如序列选择，分子量、纯度、保存稳定性、功能性实验及所有酶的酶活性等资料。引物设计应合理涵盖考核试剂扩增的靶核酸区段、位点、及所有突变型别。
5.1.1.6对所选测序方法的分析性能进行合理验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与申报试剂的相关性能进行适当比对分析。
5.1.1.7测序方法应建立合理的阳性质控品和阴性质控品对临床样本的检测结果进行质量控制。
5.1.1.8提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。
5.2病例选择
临床试验应以非小细胞肺癌肿瘤患者为主要研究对象，其中应涵盖注册申报试剂所声称的所有基因型且每种突变型别均应有一定量的阳性病例。对于阴性病例的选择，也应考虑到交叉反应验证的需要，以从临床角度考察其分析特异性。具体要求如下：
5.2.1申请人应满足临床试验所需样本总例数不少于0例，应以肺腺癌为主，还应包括一定数量的其他类型肺癌及肺部相关良性疾病。
5.2.2临床样本类型比对方式
申请人应满足临床试验所需样本总例数不少于0例，申请人还应进行至少例同源外周血样本和组织学样本对比临床研究资料。
5.2.3如申请人检测系统中包含不同类型外周血保存方法，建议每种外周血保存方法应配合申报检测系统，完成不少于例同源性临床对比研究。
5.2.4如申请人检测系统中包含不同类型核酸纯化提取方法，每种方法做不少于例同源性临床对比研究。
5.2.5EGFR新基因突变型别临床研究
依据现有EGFR个体化临床研究结论，EGFR与个体化用药的主要突变型别已被证实具有临床意义且已有同类产品批准上市；因EGFR突变基因在不同种族中人群易感性不同，在亚裔人群中发生率明显高于高加索人群，申请人在申报新的EGFR突变基因位点时，因考虑EGFR突变位点在不同人群中的差异。对于EGFR基因突变检测未在中国批准上市的新基因突变型别，在注册申报时，应提供突变类别在我国人群中的突变比例以及与分子靶向药物的关联性临床研究资料，资料中需明确新的EGFR基因突变型别与靶向药物的明确关联。
5.3.统计学分析
对于本类产品对比实验的等效性研究，对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、阴性/阳性符合率、阳性预测值、阴性预测值、kappa检验的形式总结不同对比方法的定性检测结果。统计分析应可以证明不同方法的检测结果有无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，设置a值及P值假设条件，即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。
5.3.1对于申报试剂和对比方法学建议设计统计分析表格如表11
5.3.2统计每个基因型的阳性符合率和在所有阳性病例中所占比列。如表12
表11每种EGFR基因突变型别阳性四格表分析
对比方法学
申报试剂
阳性
阴性
阳性
A
B
阴性
C
D
临床灵敏度=A/(A+C)
临床特异性=D/(B+D)
阳性预测值=A/(A+B)
阴性预测值=D/(C+D)
表12每种EGFR基因突变型别阳性率统计
试剂盒不同基因型
阳性样本例数
在所有阳性样本中所占比例（%）
在所有临床样本中所占比例（%）
TM
LR
...
5.3.3对本次临床研究中人群基本特征进行分析，例如：年龄，性别，疾病类型等建议进行统计分析，如表13
表13人群基本特征统计表
因素
所占总数比例
考核试剂
对比方法
性别
男性
女性
年龄
50岁以下
50-59岁
60-69岁
69岁以上
疾病类型
肺腺癌
肺鳞癌
腺鳞癌
大细胞癌
...
癌症分期
II
IIIa
IIIb
IV
6.临床试验总结报告撰写
根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。
6.1临床试验总体设计及方案描述
6.1.1临床试验的整体管理情况、临床研究机构选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。
6.1.2病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准。
6.1.3样本类型，样本的收集、处理及保存等。
6.1.4统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
6.2具体的临床试验情况
6.2.1临床研究所用产品的名称、批号、有效期及所用机型等信息，以及对比试验产品的注册情况。
6.2.2对各研究机构的病例数、年龄分布情况进行综合分析，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比。
6.2.3质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、质控品运行情况，对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。
6.2.4具体试验过程，样本检测、数据收集、样本保存、结果不一致样本的校验等。
6.3统计学分析
6.3.1数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程是否涉及对方案的修改等。
6.3.2不同方法学之间不同基因突变型别的阳性符合率、阴性符合率、总体符合率。
6.3.3统计分析应可以证明不同方法的检测结果有无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，设置a值及P值假设条件，即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。
对不同样本类型以及不同年龄段人群的检测结果可能存在一定差异，故建议对不同样本类型及不同年龄段人群分别进行统计分析，以对考核试剂的临床性能进行综合分析。
6.4讨论和结论
对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。
（九）产品技术要求
应符合《医疗器械产品技术要求编写指导原则》要求，明确产品各项性能评价要求以及试验方法，将申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后，并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。附录中应将待测靶基因的基因位点、引物/探针设计及来源、参考品设置、来源及验证情况、各种酶的来源、特性及验证等重点内容予以明确。
1.病理组织样本类型EGFR基因突变注册检测应主要包括以下性能指标：物理性状、试剂盒内阴/阳性对照品（质控品）的Ct值要求（包括内标）、阴/阳性参考品符合率、精密度、最低检测限等。阳性参考品主要考察对试剂盒覆盖范围内不同基因突变的检测符合性，阴性参考品则重点对申报试剂的分析特异性进行验证。
2.外周血样本类型EGFR基因突变检测试剂的注册检测应主要包括以下性能指标：试剂盒内阴/阳性对照品（质控品）的Ct值要求（包括内标）、阴/阳性参考品符合率、精密度、最低检测限等。阳性参考品主要考察对试剂盒覆盖范围内不同基因突变的检测符合性，阴性参考品则重点对申报试剂的分析特异性进行验证。
如果申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于国家/行业标准的要求。
（十）产品注册检测报告
根据《办法》的要求，首次申请注册的第三类产品应该在国家食品药品监督管理总局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续3个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家标准品的检测项目，在注册检测时应采用相应的国家标准品进行,对于目前尚无国家标准品的项目，生产企业应建立自己的参考品体系并提供相应的内部参考品。
（摘自CMDE）
治癜风遗传性白癜风能治好吗