楼市已沦为赌场,房价一跌先保银行,个人将

市场上任何大额的收购行为，都会引起广泛的 　　

既然两个前提都不成立，就得靠第三了，也就是找愿意来玩这个游戏的人。

让他们坚信，这个游戏里，永远有一个比他们更傻的人，能以更高的价位来接盘。

现在的楼市，有个很有意思的现象，大城市的人跑小城市去买房，小城市的人来买大城市的周边房。城里人下乡炒房、乡里人进城抢房。

小城市的人笑大城市的人。你以为你买的是价值洼地？我们本地人看来就是深坑一个。先不论小城市根本不缺房，而且真有刚需要买房，新盘多的是，何必买你的二手房？

大城市的人笑小城市的人。投机成立的前提是，能找到更有钱的人在更高的价位上来接盘。

连农民都在买房了，以后你的房子还能卖给谁？最有购买力的，就是正在接盘的你们了。但偏偏你们自己，又是楼市的空头，将来是要抛售的。

说来说去，楼市不就是一个擦肩相遇、互道傻X的赌场。

让我们把视野放大、综观全球。

目前，全球经济都是萎靡不振，经济增速严重下滑，各国央行放水能力都到了极限，紧缩大周期已经来临。

在这种情况下，谁能保持泡沫最小，谁就能损失最小。换句话说，自家的泡沫越小越好，别人的泡沫越大越好。

尤其是美国，希望中国持续地加杠杆了，美国才能宽松地降杠杆。

而且现在美国要走强势美元战略了，这时候人民币的国际化，还有中国连年的贸易顺差就不能忍了。怎么办？

只要中国的资产泡沫过大，资本自然会外流，美国再振臂一呼、加息缩表，自然有大笔资金转流美国。

只要中国的资产泡沫过大，资本自然会脱实向虚，没有资金来源的实体经济谈什么“中国制造”，贸易顺差焉能持久？

奥巴马想搞TPP，是想架空中国制造，如今他没搞成，反而我们自己可能要搞成了。

不战而胜，是战争的最高境界；敌人内乱，是不战而胜的最好方法。

让我们把视线收回、聚焦个人。这一切对于我们自身有什么影响？如果资产泡沫伤害了中国制造，会发生什么？

中国制造业承担中国25%左右的就业人口，如果制造业走弱，服务业也会衰落，那么一旦失业潮开启，那么资产泡沫就会炸裂。

要知道，中国现在家庭负债率已经达到了50%，就是说，相当多的购房者都是高负债、高杠杆的。

那么如果他们失业，那么手里的流动资金还能支撑多久的房贷？那么支撑不下去之后，必会断供。

在中国，无论楼市还是股市，都是羊群效应，极易被情绪感染，而非理智决策。所以，大家在买的时候都是一窝蜂地抢，抛的时候都是一连串地抛。

那么到了这个时候，炒房的人，会因为止损而抛盘；而刚需者，也会因为担心失业而提前套现。

任何金融属性的产品，一旦下跌，绝没有人愿意接盘；一旦开跌，就得跌回解放前。所以，你可以看到我们国家为什么会前有各种各样的楼市调控大招，后有如火如荼的金融去杠杆，配有逐渐向紧的货币政策。

目的有二，一是化解泡沫，在爆炸之前先拆弹；二是固化泡沫，为拆弹来争取时间。

你要知道，泡沫的控制与否，关系的不止是国家发展大计，更是我们每一个人的切身利益。无论有房无房，都将不可避免地卷入其中。

现在的楼市有三个很有意思的现象。

　　一是一边中央不断调控加码，另一边地方却在购房有奖。

　　一是新闻里轰炸房价花式下跌，实际上房价却在悄悄上涨。

　　一是一边是富人们纷纷套现离场，一边是穷人们抢房大战再起高潮。

其实，这都因为是一场赌局，空头与对头的博弈。对于地方政府来说，房地产就意味着钱。土地财政的六成，是要靠房地产来支撑的。

而钱就意味着政绩，有了土地财政收入，才能修地铁、修高速、建学校、建医院。而且地方政府之间有竞争。你不赚这钱，反而打压楼市，资金就会流向其他城市，让你的竞争对手获得升迁的机会。

更何况，对于一些三四线小城市来说，还面临着去库存压力，还需要一拨人来为国接盘呢。而开发商更是不乐意房价降的，因此，他们一边在新闻里放出房价下跌的“烟幕弹”，一跪地乞求的可怜姿态，迷惑公众的视线。

一方面，能让中央以为调控效果已现、可以减轻政策力度，一方面，能让公众以为房价已经下跌、抄底机会来临。另一边，他们却是使出了各种花招，来抬高房价。

比如开发商蓄客个，就放出50套房源。这时候你看到人山人海的场面怎么办？叫号选房只给你10秒钟时间，你说你紧不紧张？多重压力下，穷人能不抢房吗？房价能不涨吗？

但实际上，开发商已经快扛不住了，很可能要还不起债了！

截至目前，房地产企业待偿还债券规模2.12万亿元，其中未来一年将有.86亿元债券到期。数据显示，年上市房企的平均资产负债率已达77.26%。

更有甚至，有开发商冒充购房者，申请到银行贷款，从银行手里套取现金，用这笔钱来解决资金周转的燃眉之急。之后，开发商再将这种贷款抵押的房子“一房二卖”，再卖给其他人。

在这样的情况下，你现在进场了，你以为你遇到价值洼地了，你以为你捡到宝了。

有一种财富，叫纸面财富。有一种高潮，叫颅内高潮。

在你杠杆致富的美梦背后，是随时会跑路的开发商和可能还不起的贷款。

一二线城市还有资金、人口的支撑，而那些三四线小城市，明明没有什么发展潜力了，可是房价竟然还一路上涨，那完全就是炒高的价格，蕴藏着巨大的风险。

银行已经拒绝背锅了，在限贷方面层层加码。现在不少银行已经取消了首付优惠，还停发了二套贷。

当地方政府已经凭借去库存成功解套，当开发商已经胜利回款收回成本，当大户和上市公司们已经套现离场。

偌大的赌场之中，剩下的还有谁呢？

二、北京房价突然大跌，保银行比保房价更重要！

国家统计局公布了一组房地产数据，里面透露了惊天大秘密。

5月15日的数据显示，今年前4个月，商品房销售面积同比增速15.7%，比前3个月下滑3.8个百分点；销售额增速20.1%，回落5个百分点。

仅4月份，商品房销售面积增速（7.7%）就比3月份下滑7%。

近一个多月来，房价也出现下滑，尤其是北京房价出现突然下跌，北京二手房4月份成交均价环比下跌了6.8%。

截至目前，有超过55个城市，共发布楼市调控政策多次，被业界称为“史上最严”调控，主要是限购、限贷、限价和限售“四限”措施。

但是，今年前4个月房地产开发投资亿元人民币，同比名义增长9.3%，增速比第一季度提高0.2个百分点。

一方面房价下跌，销售面积增速下跌，销售额下跌，另一方面，开发商的投资还在扩大。这显然不符合逻辑，只能说房产商为了续命，不得不动用老本拿地投资。销售下滑投资扩大的房地产市场矛盾将逐渐加剧。

“销售冷投资热”的局面，从房地产市场长期的发展情况看，已陷入投资刺激和泡沫膨胀的两难和矛盾境地。

其实这也是一些地方政府的两难境地：一方面房地产投资已经成为赖以刺激经济的主要手段；另一方面，房价泡沫膨胀，存在潜在风险，所以又要同时进行降温调控。

房地产市场早已绑架了经济。从年代开始广泛实行土地财政，大规模投资房地产，依赖提高土地出让金和房价来获利和维持GDP，结果造成房地产泡沫加剧。如今骑虎难下，一直涨下去，将是灾难性的后果，但要软着陆，又考验调控智慧。

最关键是，房地产的既得利益群体很难撼动，除了广大开发商，还有很多寄生官员，有些官员动用手中权力，通过批地和更改容积率，早已窃得家财万贯。

一些地方对此也睁一眼闭眼，经济不好，还得依靠卖地收入来维持庞大的行政人员开支。随着房企的地产投资扩大，土地出让金还在上涨。中原地产的最新数据显示，今年前4个月，50个重点城市地方政府的土地出让金超过亿元，上涨53.3%。

但很显然，决策层已经深知这样走下去的危害，所以不得不下令冻结交易，通过行政命令来防止地产炒作。

前几天，央行突然大手一抖，单日释放了亿的流动性，有人认为这是不是为了保房地产？其实想多了。这不是保房地产，也不是保股市，而是保银行。

金融去杠杆，理财产品的清理，对银行影响是伤筋动骨的。这次清理和去杠杆，其实说到底就是提前还债，一旦强行推广下去，会导致很多债务违约，银行到时只能当做烂账和坏账来处理了。

央行在去杠杆的关键时刻大放水，主要是为保证债市和商业银行的流动性充足，保证不出现大规模的债务违约，以免将商业银行推向倒闭破产的境地，这应该是当前央行防止系统性金融危机的核心举措。

本次释放的亿元，都是基础货币，通过商业银行、影子银行的存贷款转化，需要乘上5左右的货币乘数，基本等于向市场投放了2.3万亿的货币量。这样的货币投放量，以前是要几个月完成，如今一天就完成了，说大放水，一点都不为过。

以前类似操作，基本上都是7天、28天这种短期操作，到期就收回。而本次亿元，投放的时间在6个月到1年，这些流动性在市场上呆的越久，产生的货币量就越大，洪水效应也越大。

但是这些水已经很难流动房地产了，因为前段时间已经对银行有很多禁令，要求不要向房地产进行贷款，很多房企不得不到境外发债，成本一下就提高了。

这一次非常明显，房地产将会成为抛弃对象，保银行、保就业会成为重点。

三、房价暴跌的后果究竟有多可怕？看完后冷汗直流

天下大势，合久必分、分久必合；天下楼市，涨久必跌，跌久必涨。有房一族，特别是贷款买房的，我侧重地问一下：房价暴跌，你怕不怕？诶，那位朋友说了，“我不怕啊，我工作稳定收入稳定，只要按时还月供，房子就还是我的呀。”

What？竟然有这么天真的朋友，欠缺人生经验，毕竟tooyoungtoosimpl！告诉你的惊天秘密：房价跌了，不管你能不能按时还贷，银行都有权收走你家房！

房产贬值，银行要你补足抵押

咱们先看看赚得多、跑得快的香港朋友的真实经历。

“年的时候我买了一套价值万港元的房子，从银行贷了.8万港元，可这间住宅到年就只值万港元了。”在香港一家律师行工作的赵伟（化名），最终由于无法拿出更多现金来弥补抵押品的价值不足，不仅房子被银行无情收走，而且还欠下银行多万港元。

这是怎么回事？

我们知道，作为贷款人，银行与借款人签订贷款合同。很多不明真相的朋友以为，只要保证月供按时交给银行，银行没有实际损失，我就不违约。危险的种子就是这样被埋下的。需要明白，贷款合同的违约条款里，可不仅仅包括不按时还款，还包括抵押物价值减少。

《银行房屋按揭贷款合同范本》显示：

“抵押期间由于乙方（购房人）的过错或其他原因造成抵押物的价值减少的，乙方应在30日内向甲方（银行）提供与减少的价值相当的担保。否则，甲方有权要求乙方提前清偿相当于抵押物价值减少部分的本、息。

如果乙方既不提供价值相当的担保又不提前清偿等值的贷款本、息，甲方有权宣布贷款提前到期，要求乙方提前清偿全部贷款本、息。”

举个例子说，你就明白了。

房价腰斩，房没了还惹一身债！

刘明白年买下一套万的房子，首付30万，贷款70万。一年后，刘明白已经偿还银行本金1万元，剩余69万元。就在那时，房价像着陆失败的火星车一样，啪叽一下，硬硬生生结结实实地砸地上了。这套房子市场价仅为50万元。好了，银行这时候会给刘明白算一笔账：当初借他70万，是因为有价值不低于70万的房子作抵押。现在，房子仅值50万，但他欠银行69万。所以，请补齐抵押不足的差额19万（69-50）。

要么，刘明白拿出19万存款，做提前还贷；要么，刘明白有个祖传老古董，价值不少于19万，抵押给银行。

刘明白这回是可犯糊涂了，当初为了买房把积蓄都掏光了，而家里最值钱的古董是iPhon4S，上哪去凑19万呢？

银行连一声不好意思都不说，“啪”一锤子就把房子拍卖了。一般说，拍卖价肯定比市场价还要低。市价50万的房，银行拍卖了40万，刘明白不仅首付白交了、啥也没捞着，还欠了银行29万（69-40）！

现在，朋友们知道房价暴跌为啥可怕了吧。已经贷款买房的朋友，快去把合同找出来，看看是怎么约定抵押物价值不足的。有的合同会在正文里专门列出一条，更狡猾的银行会在合同附件里作约定，反正，房奴是斗不过银行。房奴们唯一能期盼的，就是房价不要跌。

但是，房价怎么可能永远不跌呢？区别只是跌得深、跌得浅而已。从去年年末到今年，香港房价走入下跌周期，虽然幅度还不大，但已经引起部分购房人的恐慌。日本的例子更不必说，自上世纪90年代，日本房价暴跌之后一路走低，近几年才缓慢抬头。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[-]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholcystokinin），Conoprssin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。图1-1本论文的技术路线?第二章基于Solxa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析2.1引言河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30,hsp70,GABARAP,TPX1,和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。因此在本研究中，我们使用Solxa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。2.2材料和方法2.2.1河蚬的养殖河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录12.2.2miRNA的提取与测序首先使用天根miRcutmiRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化-nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。图2-1miRNA库建立与测序2.2.3miRNA测序数据生物信息学分析由Solxa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[,]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBas21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solxa测序在牡蛎比对中形成miRNA:miRNA*对被认为是miRNA*。2.2.4miRNA的鉴定与表达分析为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5SrRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcutmiRNAFirst-strandcDNASynthsisKit(TianGn,China)试剂盒来提取，定量液使用miRcutmiRNAqPCRDtctionKit(SYBRGrn;TianGn,China)，定量仪使用ApplidBiosystms7Ral-TimPCRSystm(LifTchnology,USA)，定量引物使用miRprimr软件[]设计，见表2-1。表2-1河蚬miRNA定量使用的引物miRNA　　forwardprimr(5’→3’)rvrsprimr(5’→3’)5srRNAaagttaagcaacgtcgagcccttagcccagttgttaccagcacf-miR-cagtgccatttttatcagtcacggtccagtttttttttttttttacagcf-miR-12cgcagtgagtattacatcaggtggtccagtttttttttttttttcagtcf-miR-acgcagtaatctcagctggt　　ggtccagtttttttttttttttcagaacf-miR-bcgcagtaatatcagctggtgtccagtttttttttttttttcaggacf-miR-67agcagacaacctgcttgaatgggtccagtttttttttttttttcctcf-miR-cagtggacggagaactga　　ccagtttttttttttttttgcccttcf-miR-10gcagtaccctgtagatccgaaggtccagtttttttttttttttacaacf-novl-14tggcactggcggaa　　ggtccagtttttttttttttttgtgacf-novl-2cagacactgcgatctattgaggtccagtttttttttttttttcttagtccf-novl-18tgccctatccgtcagtcgtccagtttttttttttttttgcagcf-novl-31　　gagctgcctgatgaagagtccagtttttttttttttttggaca2.2.5目的基因预测分析John等[]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi,hsp70,cyp4andmtallothionin)可以从ncbi上获得，使用miRanda[]和RNAhybrid[]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。2.3结果与分析2.3.1miRNA序列分析我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,,条高质量的rads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表个序列的个高质量rads（表2-2）。去除掉rRNA,tRNA,snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的rads（代表16个不同的rads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总rads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。图2-1高质量rads长度分布表2-2河蚬中不同类型小RNAs长度分布SmallRNA　　UniquRNAsPrcnt(%)　　TotalRNAsPrcnt(%)Total　　39,　　　　6,,　　rRNA11,.,,.93tRNA　　2,　　5.,　　0.36snoRNA　　19　　0.　　0.00othr　　10,.,.07miRNA16,　　40.,,　　80..3.2河蚬保守miRNAs确定为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBas21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[]。总共16个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过0测序数。miR-10测得1366个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-（），miR-（294）和miR-7（322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。2.3.3河蚬新miRNAs的鉴定因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。图2-25个表达最高的新miRNAs预测二级结构2.3.4河蚬miRNAs的荧光定量为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novl-2,Novl-14,Novl-18andNovl-31)和8个保守的(miR-10,miR-12,miR-67a,miR-,miR-a,miR-b,miR-andmiR-)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novl-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novl-14和Novl-18在腹足和外套膜中表达丰富，在鳃和内脏团表达量低。Novl-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novl-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。图2-38个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平2.3.5河蚬miRNAs目的基因的预测为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），mtallothionin基因是miR-7的目标。miR-，miR-2b和Novl-40可能与调控河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。图2-4miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系表2-3miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi,hsp70,cyp4和mtallothionin的关系Gns(gnID)miRandaRNAhybridConsrvd　　Novl　　ConsrvdNovlgst-pi(AY885.1)　　miR-,miR-8a,miR-8bNovl-30,Novl-38miR-　　Novl-1*,Novl-4hsp70(KJ.1)miR-,miR-2a,miR-2b,miR-2c　　Novl-40　　miR-,miR-2b,miR-34,　　Novl-29,Novl-40cyp4(JQ.2)miR-10,miR-,miR-　　Novl-30,Novl-15,Novl-23,Novl-36　　miR-10,miR-,miR-,miR-,miR-a,miR-b,miR-34,miR-7　　Novl-1*,Novl-14,Novl-17,Novl-29,Novl-3,Novl-4mtallothionin(EF.1)　　miR-,miR-,miR-7,　　miR-7,miR-Novl-20,Novl-29,Novl-31,Novl-6a,Novl-6b,Novl-82.4讨论我们使用Solx测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1aandHoxB3a基因[]，DavidHassl等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox基因共表达，能调控Hox转录本的翻译[]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[]报道了牡蛎中miR-b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[]研究发现miR-的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。河蚬新miRNAs的表达量低，在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于0，绝大多数测序数小于[]。我们的结果与之前的研究是一致的[,]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。2.5本章小结在本研究中，我们使用Solx深度测序总共从河蚬小RNA库获得28条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。第三章河蚬CCK,Conoprssin和FFamid神经肽基因cDNA全长克隆3.1引言目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conoprssin和FFamid神经肽作为研究基因。本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conoprssin和FFamid神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。3.2材料与方法3.2.1实验材料3.2.1.1试剂TRIzol购自Invitrogn(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT）18、DNasI和dNTP购自Promga（USA）公司；bp和0bpladdr购自天根生物（北京，中国）公司；SMARTRACEcDNAamplificationkit购自Clontch(USA）公司；TaKaRaMiniBESTAgarosGlDNAExtractionKit,pMD20-Tvctor和E.coliJM感受态细胞购自TaKaRa(Dalian,China）公司；三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。3.2.1.2实验仪器CntrifugR离心机(ppndorf,USA）PowPacBasic电泳仪(BIO-RAD,USA）GlDocXR+凝胶成像仪(BIO-RAD,USA）梯度热循环仪（Vritithrmalcyclsystm）（LifTchnologis，USA）MultiskanGO酶标仪（ThrmoScintific，USA）荧光定量PCR仪7Ral-TimPCRsystm（LifTchnologis，USA）3.2.1.3统计分析与绘图软件SPSS16.0软件，Origin8.0软件3.2.2河蚬的实验室养殖河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5mm左右的细沙，所用水为目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC，水质硬度在mg/L以下,光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。3.2.3RNA提取和cDNA合成3.2.3.1.RNA提取操作步骤：河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下：(1)取50-mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5mlEP管，迅速加入-μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的μLTrizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。(2)以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温放置3min，然后放入离心机，4℃，10转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。(3)每管加入uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。(4)10g，4°C，离心10min，弃上清，此时RNA沉于管底。(5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。(6)0g，4°C下离心5min，尽量弃上清。(7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA溶于无核酸水中。利用DNA的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD/OD.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。3.2.3.2.去除RNA中的DNA（1）用RNas-frDNas去除样品中DNA污染。DNasⅠ消化处理反应体系(20μL）RNA　　16μLDNasⅠ　　2μL10×DNasⅠBuffr　　2μLTotalvolum20μL（2涡旋混匀后，37°C水浴30min。（3）加入RQ1DNasStopSolution1μL，混匀，瞬时离心，65°C反应10min。（4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A/A大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。3.2.3.3.cDNA第一链的合成首先使用MultiskanGO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promga

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