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实验专栏丨做完lncRNA测序，怎么选
验证实验设计的逻辑是这样的：
如果是发现新的lncRNA：
如果是发现样本间lncRNA差异表达：
实验选择是这样的：
1.验证发现的lncRNA是真实存在的
·可以通过提取RNA做sanger测序验证；
·可以通过probeqPCR，不仅可以对序列进行验证还可以同时检测lncRNA的表达水平，一举两得哦！（具体原理戳这里：做完RNA－seq，怎么做验证实验？）
2.验证lncRNA表达水平存在差异
与差异表达mRNA的验证方法相同，设计引物做qPCR验证就OK了，或者做个northern-blot既可以验证RNA的表达丰度又可以验证序列信息，这里就不多做介绍了，大家可以根据自己需求选择。
验证功能
如果你觉得做完上面的实验就结束了，小编只能遗憾的告诉你，文章也就登个3分左右的期刊。那么多数据想想确实有些浪费，特别是有新发现。再下功夫做点下面的实验，进一步提高您文章的水平。功能验证完全不知道怎么入手肿么办？
小编为大家总结了lncRNA验证涉及实验概念，赶紧先睹为快！
1、cDNA末端快速扩增
目的：确定lncRNA5’和3’末端序列，进而获得lncRNA的全长信息。
原理：在cDNA合成或第二链cDNA合成的过程中末端序列外侧引入接头序列，通过接头引物和基因特异性引物进行PCR扩增，PCR产物经克隆测序获得末端序列信息。
2、RNA免疫沉淀
目的：IP是研究RNA蛋白相互作用的重要手段，利用RIP可以研究在体内蛋白是否与lncRNA发生相互作用。
原理：利用目的蛋白的抗体免疫沉淀蛋白RNA复合物，从沉淀的RNA蛋白复合物中纯化RNA，进行定量PCR分析。
3、荧光素酶报告基因
目的：检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种方法。
原理：荧光素酶可以催化荧光素(luciferin)氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，进而检测转录因子与目的基因启动子区DNA是否发生相互作用。
4、RNApulldown
目的：RNApull-down实验主要用来鉴定与目的lncRNA结合的蛋白配体。
原理：蛋白与生物素标记的RNA孵育结合，富集的蛋白通过SDS-PAGE分离，最后选择特异性蛋白条带进行质谱鉴定。
5、染色质免疫共沉淀
目的：ChIP主要用于研究lncRNA—蛋白质—染色质DNA相互作用，探究lncRNA对特定染色质修饰蛋白或转录因子的调控作用。
原理：在活细胞状态下固定蛋白－DNA复合物，超声将DNA随机打断为一定长度范围内的染色质小片段，再通过抗体捕获蛋白－DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
案例分析
小编结合两篇系统性研究lncRNA的经典案例，从分子机制研究及肿瘤基础研究两方面，与大家聊聊lncRNA测序及后期验证该怎么做。
1、分子机制研究
lncMyoD通过阻碍IMP2介导的mRNA翻译调控骨骼肌分化
期刊：DevelopmentalCell
IF：9.
文章简介
本文应用RNA-seq技术，寻找成肌细胞与早期肌管的差异分子，发现并鉴定出lncMyoD，并从其对邻近靶基因MyoD与下游基因调控方式两方面探讨lncMyoD的调控机制。
分析思路
1、发现和鉴定lncMyoD
A.RNA-seq寻找差异分子；
B.根据基因位置关系确定lncMyoD。
2、lncMyoD序列及表达模式特征
A.RACE确定lncMyoD序列；
B.lncMyoD表达的时间、空间及组织特异性分析；
C.lncRNA被定位于细胞核，在成肌细胞及肌管中特异性表达并具有时间特异性；
D.lncMyoD编码蛋白能力生物信息学预测及实验验证，无蛋白编码能力。
3、lncMyoD是MyoD的直接靶标
A.沉默lncMyoD不影响MyoD基因表达，而沉默MyoD基因可使lncMyoD表达下调，从而得出结论：MyoD在lncMyoD的上游；
B.通过CHIP和荧光素酶报告基因实验，验证MyoD可介导lncMyoD的转录激活，从而上调lncMyoD表达。
4、筛选lncMyoD下游调控靶基因
A.为寻找lncMyoD调控的下游靶基因，通过RNApulldown检测到IMP2蛋白；
B.lncMyoD表达沉默后IMP2蛋白水平上调。（研究发现IMP2蛋白能直接结合并调控IMP2mRNA，从而增加其自身mRNA的稳定性或翻译。lncMyoD表达沉默增加了IMP2蛋白和IMP2mRNA的结合稳定性，使得IMP2蛋白水平上调。）
C.lncMyoD负向调控IMP2介导的增殖基因（N-Ras和c-Myc）的翻译。（lncMyoD竞争性的结合IMP2蛋白，使得IMP2介导的增殖基因（N-Ras和c-Myc）的翻译受阻。）
2、肿瘤基础研究
Lnc-GCASPC作为MiR-17-3P靶标，负向调控胆囊癌PC蛋白依赖性细胞增殖
期刊：Cancerresearch
IF：8.
文章简介：
本研究表明lncRNA-GCASPC在肿瘤组织中表达量下调，在胆囊癌（GBC）发展中发挥关键作用。lncRNA-GCASPC是miR-17-3P的靶标基因，且能够负向调控丙酮酸羧化酶（pyruvatecarboxylase，PC）的表达，为揭示胆囊癌中lncRNA调控细胞增殖机制，阐明其致病机制提供新的基础。
分析思路：
1、分子筛选及鉴定
A.针对5个胆囊癌患者的癌及癌旁组织进行表达谱测序，分析差异表达的lncRNA及mRNA；
B.应用qRT-PCR在15对癌及癌旁组织样本中验证，筛选出肿瘤组织中显著下调且保守的lncRNA-GCASPC（以下简称GCASPC）。加大样本量验证，证实GCASPC在个GBC病人组织样本中显著下调，并与病人预后相关；
C.生物信息学预测蛋白编码能力，确定lncRNA-GCASPC无蛋白编码能力；
D.鉴定lncRNA表达特异性，定位于细胞质。
2、细胞及动物实验的功能验证
A.细胞实验：过表达GCASPC能够抑制细胞增殖，敲除GCASPC能促进肿瘤生长；
B.动物实验：GCASPC表达与肿瘤大小相关，且与肿瘤分期、预后相关。其表达量越高，预后效果越好。
3、lnc-GCASPC下游靶分子的功能验证
A.通过RNApull-down及质谱检测，发现了下游靶分子-丙酮酸羧化酶（pyruvatecarboxylase，PC）简称PC蛋白；
B.过表达GCASPC，PC蛋白表达活性下降、mRNA水平无变化，表明GCASPC可能是通过翻译或翻译后调控PC蛋白的表达活性。
4、lnc-GCASPC上游分子miR-17-3p研究
A.miRDB预测到miR-17-3p可与GCASPC配对，并通过荧光素酶报告基因验证两者具有结合作用；
B.干扰/过表达miR-17-3p能影响GCASPC的表达，而干扰/过表达GCASPC不引发miR-17-3p的表达变化，验证GCASPC是miR-17-3p的靶基因；
C.验证miR-17-3p的功能，敲除后可抑制细胞增殖。
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