寡核苷酸的分析和纯化

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寡核苷酸成为近年来药物研究的热点，是基因靶向治疗类药物，用于治疗病毒、肿瘤和遗传病。寡核苷酸通常是指含有10~50个碱基的RNA或DNA分子及其类似物。根据其药物作用的机理主要分为：干扰RNA(small-interferingRNAs,siRNAs)，反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides,ASOs）以及核酸适配体（Aptamer）等。目前寡核苷酸基本上都是采用化学方法合成，通常是固相亚磷酸三脂法合成，并采用高效液相色谱法进行分离纯化，其中反相离子对色谱法以其快速、高效的优势最为常用。药明康德从年初开始了寡核苷酸的固相合成研究，为配合公司的业务发展，药明康德研究服务部核心分析部开始了寡核苷酸分析分离能力的建设，建立了寡核苷酸的分析和分离平台。

图1寡核苷酸固相合成路线图(图片来源：参考文献[3])

寡核苷酸分析平台

寡核苷酸的分子量比较大，一般在5,~15,左右，寡核苷酸具有较强的电负性和疏水性，在水相中基本以阴离子形式存在，形成一个负电荷聚集的分子体。其在常规的反相色谱柱上保留很弱，且峰形很差，必须在流动相中加入离子对试剂。一般情况下，首先将六氟异丙醇体系作为首选的分析体系，然后再根据不同结构特点的寡核苷酸调整六氟异丙醇和三乙胺、正己胺等的浓度，基本可以满足目前各种类型的DNA、RNA及修饰的寡核苷酸的分析。

图2目标N序列中N-1,N-2失败序列DNA纯化

色谱柱:ClarityOligo-RP,3μm,?,4.6×mm;

流动相:A:50mMTEAApH7.5B：甲醇柱温：55℃

样品:22merDNA

药明康德研究服务部核心分析部配备了种类规格齐全的实用于寡核苷酸分析的色谱柱，并建立了针对寡核苷酸分析的方法筛选平台，可快速、高效地实现寡核苷酸的分析方法开发。目前已经成功分析了一百多个寡核苷酸分子及其杂交分子。图2采用小粒径的C18柱（ClarityOligo-RP,3μm,?,4.6×mm）针对22个碱基的寡核苷酸实现了N和N-1、N-2等的分离。

寡核苷酸分离平台

对于寡核苷酸的分离纯化首要考虑的问题是成本与效率。离子交换色谱法相对来说是成本较低的分离手段，但从效率上来看，反相离子对色谱法更胜一筹。反相离子对色谱法综合了离子交换色谱和反相色谱两者的特点，流动相是加入离子对试剂的甲醇或乙腈水溶液，分离快速高效，是目前人工合成的寡核苷酸分离纯化最理想的方法。寡核苷酸固相合成的规模一般不大，重量在毫克级水平。

根据寡核苷酸的结构以及毫克级交货量的特点，药明康德研究服务部核心分析部对现有仪器进行改装，采用HPLC分析系统和Gilson液体平台，搭建了微量制备系统，开创性地在分离纯化上引入了六氟异丙醇-三乙胺离子对反相体系，结合常规的乙酸三乙胺和离子交换色谱体系，可分离毫克级规模的寡核苷酸，目前已经分离了近百个寡核苷酸分子及其杂交分子，成功率大于95%，已经初具规模。

Analysis

a)HPLCchromatogramofcrudeRNA(21mer)

Purification

b)Prep-HPLCchromatogram

QC

C)HPLCchromatogramofRNAafterseparation

图3寡核苷酸分离流程

参考文献：

[1]于铁成，王岩，刘建国，等.小分子干扰RNA和反义寡核苷酸技术的比较及其应用意义[J］．中国组织工程研究与临床康复，，2(36):-．

[2]LinCY，HuangZ，JaremkoW，etal.High-performanceliquidchromatographypurificationofchemicallymodifiedRNAaptamers［J］。AnalBiochem，():-．

[3]寡核苷酸固相合成路线图由上海药明康德新药开发公司药物研发国际服务部提供

[4]ApffelA，ChakelJA，FisherS，etal.AnalysisofOligonucleotidesbyHPLC-ElectrosprayIonizationMassSpectrometry.

关于药明康德研究服务部

药明康德研究服务部拥有一个超过7,人的科学家团队，结合药明康德尖端的化学、生物学、肿瘤学及免疫学等技术平台，为全球客户提供顶尖的一站式药物发现及研究服务。我们的服务涵盖药物化学、合成化学、化学分析、DNA编码化合物库、免疫肿瘤学、体内肿瘤模型、CRISPR、分子及细胞水平的药效检测、高通量筛选（HTS）、早期安全性评估、各类大，小动物药效模型（心血管疾病，呼吸类疾病，糖尿病和肥胖症，脂肪肝，神经退化和认知障碍，疼痛，睡眠，精神类疾病，病毒及细菌感染模型）、结构生物学、免疫学以及临床生物标志物检测服务。

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