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新技能引物还可以这样设计,你想到了吗



你见过上图这样的引物吗?

由于形似Ω,我们称它为OmegaPrimerTM。Omegaprimer是由3个功能区段组成:

3p臂(3parm):聚合酶延伸反应的启动子。

5p臂(5parm):结合DNA模板序列的锚。

分隔两臂的环(loop)。这个环是做什么用的呢?

这么“怪”的引物有什么与众不同吗?

还真是大有不同。这样的设计从根本上优于传统的引物。不信,你往下看:

大幅提升特异性

Omegaprimer需要3p臂和5p臂同时特异结合模板(templateDNA)。这种要求,相比于传统引物,会显著增加引物的特异性(见下图)。

具有宽容模板变异的能力

在某些应用中,可有目的地将5p臂设计的较长,以便它能杂交相应的模板,即使该模板中存在一个错配(例如,1个SNP)。这是一个非常有用的特性并具有实际的应用价值。如果考虑到,在拥有30亿个碱基对的人类基因组中有万个高等位基因频率(1%)的SNPs,平均每50bp就有1个SNP,你就会懂的。

大幅降低引物二聚体

可扩增的引物二聚体只在这种情况下产生:当两个引物的3p臂相互杂交,并且至少一个引物的3’末端互补结合到另一个引物上。omegaprimers通常具有比常规引物(35nt)更短的3p臂(16nt),因而在统计学上形成可扩增的引物二聚体的概率要小的多。

扩增子中容纳更长的真实序列

一个扩增子的测序读段是由真实序列和引物序列两部分组成。引物的3p臂会纳入扩增子成为引物区段的一部分。由于omegaprimers具有比常规引物更短的3p臂,因而,由omegaprimers生成的扩增子中真实序列区段会占有更高的比例。

OmegaPrimerTM提升特异性超过26,倍!

Omegaprimer是设计为与相应的模板杂交,形成稳定的环状结构。在上图中,当3p臂与模板间存在错配时,会动摇环状结构的稳定性,导致3p臂从模板上分离,并降低聚合酶延伸引物的概率。形象的说,环结构像是个弹簧,当3p臂与模板链出现个别碱基错配时,这个弹簧就会把3p臂弹开,聚合酶延伸反应也就无法正常进行。此外,由于3p臂较短,其自身并不具有足够的结合模板的能力,也无法支持有效的聚合酶延伸反应。根据概率模型计算,这样的设计使引物特异性提升超过26,倍。

那么问题来了,OmegaPrimerTM是用来做什么的呢?

你猜到了吗?请将你的答案发至market

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