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甩你8条妙计轻松搞定引物设计第六条
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第六条
原来分子信标引物设计可以这样
分子信标的设计
分子信标（TyagiandKramer)是另一种特异的荧光实时PCR探针（图1),这种分子信标可以在体内和体外动态地、实时地检测核酸杂交事件（TyagiandKramer;Kostrikisetal.;Tyagietal.)。
图1
分子信标是一段双重标记的寡核苷酸（25~40nt）形成具有一个环（探针）和一个自身互补的茎的发夹结构。荧光报告分子在5端，猝灭剂在3端。
室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告物质和猝灭剂分子通过探针自身互补形成的茎结构紧靠在一起，因此抑制了荧光信号。
当PCR退火时，如果探针遇到靶DNA序列，根据热力学原理，信标将优先和靶DNA结合而不是形成发夹结构。由于茎结构被破坏，荧光报告物质与猝灭剂相互分离，报告物质得以发射荧光（见图1)。
传统的寡核苷酸杂交必须淸除未杂交的探针分子，以消除背景影响。利用分子信标的杂交在没有靶DNA存在的情况下荧光剂与猝灭剂可以稳定地结合在一起，不发射荧光，因而背景很低。因此，可以省略清洗探针这一步，而且，随着扩增的进行，分子信标结合于靶DNA的比例逐渐增加，发射的荧光逐渐增强，因此荧光强度与PCR产物的累加是直接相关的。
由于茎环结构很稳定，分子信标与线性探针相比具有较高的选择能力，可以对只有一个核苷酸差异的靶序列进行辨别，使其成为研究单核苷酸多态性（SNP）的理想工具。完全匹配的探针-靶DNA复合体比分子信标单链形成的发夹结构更为稳定，而发生错配的探针-靶DNA复合体一般不太稳定，即使只有一个碱基对的错配也如此，这一热力学特征是分子信标高度特异性的基础。
分子信标在许多定性和定量检测研究中应用越来越广泛。它被用于实时检测DNA扩增量的实时PCR(TyagiandKramer)它可以用多种染料标记，用来进行实时荧光基因型鉴定（Kostrikisetal.;Tyagietal.)和在医疗诊断时同时检测样品中不同的病原体（Vetetal.)。
分子信标也可以在活体细胞中检测RNA转录物（Sokoletal.)、检测DNA结合蛋白（HeydUkandHeyduk)。分子信标还可以应用于实时PCR、端点PCR和RT-PCR实验。
1.设计路线为了成功地检测PCR,分子信标必须在退火温度与靶DNA结合，而未结合的探针则保持闭合的无荧光状态。退火温度和缓冲液会影响探针的特异性，师兄（师兄ing）觉得这个必须要认真处理。loop环（即探针区）应具有靶特异性，两侧可以形成发夹结构的互补序列。设计信标时，通常应遵循以下路线。
（1）探针区应为15~33bp长，且环序列必须与靶DNA序列互补。
（2）探针区的Tm值应该比PCR的退火温度髙7~10倍(参照GC含量预测规则），而且要在附加茎结构序列之前单独估测探针序列。
（3）为了保证信标优先与靶序列杂交，探针必须与靶序列二级结构较少的区域互补。靶DNA的二级结构用序列分析软件分析，如UNAFold(MichaelZuker，RensselaerPolytechnicInstitute,Http://白癜风可以治愈吗海口白癜风专科医院
