realtimepcr引物筛选

所谓引物筛选：即将某一基因设计出的多个引物进行验证，最终筛选出合适自己试验的引物的过程；

引物筛选的流程：

根据基因名称和种属，在NCBI网站上查询相关的基因的序列信息；

查询基因序列过程中会有很多点需要注意，

比如：A.所检测的基因与其他基因是否有同源性片段？如果有同源性片段，设计引物时需避开同源性片段，否则，即使设计出的引物是好用的，但扩增出来的片段并非全部是你想要检测的片段---目的产物不纯（可通过跑焦验证）；

B.当检测的基因有很多转录本时，需要根据实验的具体要求来设计引物，如果是检测所有转录本设计引物时，需在所有转录本的同源片段处设计引物；如果只是检测其中的某个转录本，只需针对于特定转录本设计即可；

2.设计引物：

每一个基因最好设计2对引物，大多数基因都是可以设计出很多对引物的，但这些引物里分次优；设计2对引物主要是可以比较保险的找到合适自己实验的引物。国外做realtimepcr实验前，设计引物每个基因至少设计4-5套引物，全部用来做实验，用最好的数据发表论文，所以可以得高分，但他们发表论文时通常不会将最好的那对引物放在论文中，所以，国内很多研究生做QPCR实验时经常抱怨论文中的引物为何不好用；如果是针对很多引物基因设计时，最好保证所有基因的退火温度保持接近，以便于可以讲所有基因放在一起检测；

3.引物的合成：

引物的合成主要根据设计出的引物序列进行合成，市场中很多合成公司都可以合成，纯化级别：PAGE级纯化；

4.预实验验证；

实验前最好使用2-3个样本的cDNA对所设计的引物进行验证，主要目的，A.根据预实验可以直接看出前面设计出的两对引物中那一对比较好，正式试验使用最好的那一对；B.通过预实验也可以提前了解到自己样本的基本情况，以及实验的反应条件；产物的扩增曲线、溶解曲线、产物的TM值等；

一下为biotnt设计出的引物的扩增曲线和溶解曲线：

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1.mRNA引物筛选服务：元/对；

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