中国农业大学重金属离子的数字PCR检测

在电镀和燃煤等过程中产生的重金属离子如二价汞离子Hg(II)和一价银离子Ag(I)对人体具有严重的毒副作用。Hg(II)和Ag(I)往往是人体代谢过程中一些重要酶的抑制剂，如谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、半胱氨酸、金属硫蛋白、超氧化物歧化酶等等；此外Hg(II)和Ag(I)还能导致渗透调节的异常和DNA的损伤。所以对于Hg(II)和Ag(I)的含量需要一种非常灵敏的检测手段，从而对环境质量进行评估。一些国际组织和国家还对食品和饮用水中Hg(II)和Ag(I)的浓度上限做出了规定，如WHO规定在食品中Ag(I)的浓度上限为0.05mg/L，饮用水中Hg(II)的浓度上限为6ng/mL。本期介绍由中国农业大学利用微滴式数字PCR完成的工作，利用错配碱基在Hg(II)和Ag(I)存在的情况下延伸扩增模板的特点，对Hg(II)和Ag(I)的含量进行检测。ddPCR检测方法1检测原理。正常情况下，T-T和C-C的模板-引物3’端的组合不能形成碱基配对并在DNA聚合酶的作用下进行扩增。当反应体系中存在Hg(II)和Ag(I)时，T-T和C-C的碱基组合就能形成稳定的结构并引发第一轮扩增。在第一轮扩增产物的基础上，采用通用引物（UP）、特异性引物（P1、P2）及特异性的探针B1（FAM标记）、B2（VIC标记）进行ddPCR检测。通过FAM和VIC对应的阳性微滴的个数就能分别对Hg(II)和Ag(I)的浓度进行检测。原理示意见下图（DNA模板可通过化学合成得到）。2仅存在一种重金属离子的检测(Hg(II)或Ag(I))，下面以Hg(II)为例。ddPCR检测体系设计见下图A部分。随着Hg(II)浓度的升高，FAM检测通道对应的阳性微滴数目逐渐增多。检测下限为1nM，检测线性范围：1~nM，具体结果见下图B部分。Hg(II)浓度低于1nM的情况下，检测结果定义为0；浓度大于1nM的情况下，检测结果定义为1；并根据浓度的不同分别表示为1a、1b、1c和1d，同时对应不同的阳性微滴数。例如阳性微滴个数小于7的情况下，定义为FALSE，具体结果见下图C部分。最后下图E部分显示了Hg(II)浓度在1~nM的情况下，浓度与阳性微滴的数目具有良好的相关性，R^2=0.99。类似的，利用上述方案对Ag(I)也能得到相同的结果。3存在一种或两种重金属离子的检测。ddPCR检测体系设计见下图A部分，FT引物检测Hg(II)，RC引物检测Ag(I)。当Hg(II)存在时对应蓝色的阳性微滴（FAM标记），当Ag(I)存在时对应绿色的阳性微滴（VIC标记），具体结果见下图B部分。结果的判断与上述类似，浓度低于1nM的情况下，检测结果定义为0；浓度大于1nM的情况下，检测结果定义为1；并根据浓度的不同分别表示为1a、1b、1c和1d。下图C和D显示了Hg(II)和Ag(I)分别存在和同时存在时的结果。4实际样品的检测。在自来水中分别加入3nMHg(II)、8nMAg(I)或同时加入3nMHg(II)、8nMAg(I)进行检测，检测结果与预期一致，具体结果见下面表格。同时也说明ddPCR方式在检测过程中可防止水中病原微生物、杂质等的干扰。意义与展望01本研究首次根据重金属离子的特点，基于数字PCR的检测方法实现了对Hg(II)和Ag(I)的高灵敏度、特异性检测。本研究建立的方法还能应用于其他重金属离子的检测，如Cu(II)、Ni(II)、和Co(II)。02如果从“生物计算机”的角度出发，本研究将不同重金属离子的特性与数字PCR检测的特点结合在一起，建立了基于DNA分子的不同逻辑门，如本研究中的YES、OR、AND。封面图片来自网络。欢迎个人转发分享，







































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