DNA酶切

DNA大家都知道咯，真核生物的遗传物质嘛，小学生都知道好不啦，决定你是不是你爸妈的娃的，(￣▽￣)”哈哈哈~~~DNA重组技术的首步骤就是从DNA上将所需要克隆的DNA片段特异性切下，同时选择载体DNA，打开对应的口子，最后将他们通过连接酶连接成重组DNA分子。其中，“切下“这一步就是我们这次想要讲的酶切，也称为特异性的切割，通常由特定的限制性核酸内切酶来完成。来张美美的示意图：简介限制性内切酶，特异性识别一段DNA序列，在特定的位点上进行DNA的切割。现如今主要有三类：I类、II类、III类。Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅱ类酶由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类酶切后能够产生DNA的粘性末端或者平末端，在分子克隆中应用广泛。废话不多说，动起手来！！试剂待用的DNA样品、限制性内切酶、酶切缓冲液、无菌双蒸水。（听起来要切特定的部位啊什么的貌似复杂，操作起来简单的不行啊，就是大杂烩炖锅，让他们反应就好了咯。）实验步骤：1.准备洁净的0.5mlEP管，按照下表配置试剂，混匀，再短离几秒钟使得反应液体置于管底。2.将上述EP管置于37℃恒温水浴锅中（将管子插在浮漂上，一般喜欢这么干），酶切2h左右。3.酶切2h左右的时候，可以取少量样品采用电泳检测其是否酶切完全，确定完成后进行酶失活操作（65℃保温20min，比较常用；或者可以加入loadingbuffer使酶失活）。4.最后就采用电泳对结果进行检测即可。注意事项：1.酶切的温度很重要，大部分的酶选择37℃既能满足要求，也有少许酶的反应温度为其他温度，因此需要根据具体问题具体分析，保证酶切的顺利进行；2.反应时间一般2h左右，对于不熟悉的酶切反应，可在中途取少量的DNA进行检查看是否酶切结束，进行条件的摸索从中选择对应酶切的最佳时间；3.DNA纯度：DNA样品如果含有其他杂质比如蛋白质，RNA等，会对酶切产生影响；DNA浓度也不宜过高，一般控制在1μg/μl左右能取得好的酶切效果。4.还有包括DNA的甲基化程度、分子结构、以及溶液中离子浓度及种类、缓冲液的pH值等等，均会影响其酶切的效率。冬天要来啦，小伙伴们注意添衣保暖哟，做实验的同时也要注意身体哦。

还没看够？

Freescience精彩内容回顾（点击即达）

论文信号通路图，模式图，全搞定

谷歌不能上？有这个，一劳永逸

临床统计傻瓜式解决

外文写作润色神器

不花钱下载SCI全文黄金攻略！

PubMed有哪些被你忽视的细节？

SCI文献管理之黄金攻略！

卸载Visio—超赞的在线流程图制作工具

论文查重！关键是不要钱！

神器！分分钟找到高质量的目标文献！

生存分析从理解到作图妥妥的

科研作图神器GraphPad

菜鸟写国自然-4：立项依据的写作

零基础不一样的实验protocol:开篇引言

引物设计？现成的随便拿啦！

实验技能：小鼠尾静脉注射

Western百败百战老学姐的心酸笔记

零基础Meta系列（十）：一般套路(纯干货)一盏茶一篇meta（四）—SNPMeta，数据库寻找靶基因

网状meta分析（NMA）-第一卷基本技能

段子手韩春雨老师

不得不扒的女神--胡海岚

扒一扒你所不知道的浙大PMCB团队（内嵌新春大红包！）实例讲解:基因数据库的利用（二）

生物医学大数据解读和分析——构建生物网络实践

科研路，不孤单！

^^

Freescience医学科研联盟全国火热招募ing

50医院的小伙伴已经加入啦，点这里

Bioart/Freescience科研沙龙，实验专题，详情进入沙龙QQ群，点这里

FS科研软件库，集合60+医学科研必备神器，现在统统打包分享，点这里

科学自由共享投稿请扔至：freescience

zju.edu.cn未经许可不得转载长按







































北京还能治疗白癜风吗
北京哪些医院白癜风最好

转载请注明：http://www.qzhgr.com/ystl/12094.html