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SciRep5228Labelf
CellulasefromTrichodermaharzianuminteractswithrootsandtriggersinducedsystemicresistancetofoliardiseaseinmaize.
SciRep.Nov10;6:.doi:10./srep.
研究背景
植物与多种有害或有益的微生物天然共生，因此植物感应病原入侵并迅速增强防御响应的能力对其生存至关重要。植物诱导性抗性（ISR）和系统获得性抗性（SAR）是植物抵御病原性细菌的两种方式。哈茨木霉可通过关键蛋白—C6锌指蛋白（Thc6）使植物获得对弯孢霉叶斑病的诱导性抗性。在ISR系统，防御响应信号可以从地下根系传导到地上叶部来保护植物对抗叶斑病。但是目前为止，对于这些信号传导机制尚未有实质性研究和报道。
样本来源
接种野生型哈茨木霉玉米叶片Vs接种哈茨木霉基因突变菌株玉米叶片
蛋白质组学相关技术：Labelfree，三个生物学重复
实验结果
转录因子Thc6调节的基因筛选
Thc6表达对酵母细胞的生长没有显著影响（Fig1A）。空白对照的质粒中（Fig1D），无论是上清液还是沉淀中都没有目标蛋白条带（1,2），而表达Thc6的质粒上清液中在60kDa有明显的条带（3），接着对目标蛋白进行纯化（4）
Fig1ScreeningforgenesthatareregulatedbythetranscriptionfactorThc6.
有相互作用的基因全长扩增及分析
RACE法扩增目标DNA序列全长，分析了Thph1和Thph2的序列信息。根据酵母单杂交的实验结果，选取了bp和bp两个ATG位点。分析发现，Thph1和Thph2的启动区分为三部分。设计引物获得目标片段，PCR扩增后进行EMSA实验（Fig3A）。结果表明Thph1启动区的第二部分和Thph2启动区的第三部分与Thc6存在相互作用（Fig3B）。进一步将Thph1和Thph2的启动区分为五部分，发现Thph1启动区的第二部分和Thph2启动区的第四部分与Thc6存在显著的相互作用（Fig3CD），分别包含5‘GGCTAAA和5’GGCTAAA序列。而这两个基序正是启动子上的蛋白结合位点。
Fig3AmplificationofthefragmentsoftheThph1andThph2genepromoters.
Thph1和Thph2基因分析
NCBI数据库分析结果显示：两个基因属于纤维素水解酶，保守的纤维素结合域位于Thph1的C端和Thph2的N端。Thph1蛋白与cbh1（外切葡聚糖纤维二糖水解酶1）有高达82.6%的序列相似性。Thph2蛋白与cbh2（外切葡聚糖纤维二糖水解酶2）有高达85.7%的序列相似性。通过基因敲除，对Thph1和Thph2对纤维素的利用率进行检测，进一步验证Thph1和Thph2的功能。相比野生型，Thc6突变体对纤维素酶的利用率没有明显变化，而Thph1、Thph2、Thph1和Thph2基因敲除的菌株生长缓慢，对纤维素的利用率下降。表明Thc6、Thph1和Thph2在纤维素利用方面发挥重要作用。并随后做了进一步功能验证。农杆菌介导转化实验结合显微镜检及RT-PCR表明：Thph1和Thph2基因敲除突变体在玉米根系的定植显著下降。突变体菌株的ROS含量也发生显著变化。对叶片的病变部位也进行了检测，结果表明这些基因对抗病性也有显著影响（Fig8）。
Fig8EffectoftheThph1andThph2genesonTrichodermacolonization,reactiveoxygenspeciesproductionandlesioninhibitioninmaize.
木霉菌诱导的防御基因表达分析
之前的研究表明，防御相关的基因表达与木霉菌浓度和处理时间有关，该研究进一步分析了木霉菌侵染后不同时间的玉米叶片中防御相关基因的mRNA表达水平，以期探索茉莉酸/乙烯相关的信号传导途径。结果表明防御相关基因的mRNA表达与木霉菌处理时间和DNA浓度呈正相关。而Thph1和Thph2蛋白也可显著增加防御相关基因的mRNA表达水平。Thph1蛋白使木霉菌中的茉莉酸含量显著升高。突变体和野生型菌株对玉米的根重、梢重、病斑大小也有显著影响。
蛋白组学分析
ΔThph1基因敲除和野生型菌体中提取蛋白用于高通量蛋白组学定量分析。在样品中提取到了符合质谱分析条件的蛋白（Figure10A），采用高通量Label-free质谱技术鉴定到种蛋白。将43个差异蛋白分为三大类，21个亚类，其中14个下调表达，12个上调表达（Figure10BC），并对这些蛋白进行功能注释（Figure10D）。Thph1和Thph2蛋白可诱导玉米叶片中活性氧（ROS）含量的暂时增加，也提高了细胞内的钙浓度。在接种野生型Th22霉菌的玉米样本中，与茉莉酸/乙烯信号通路相关的基因上调表达。但Thph1或Thph2基因敲除突变体却无法刺激免疫防御相关的基因表达来抵御病原入侵。因此，推测Thph1和Thph2可能在木霉菌诱导的玉米ISR中是必需的。
Figure10Globalexplorationofdefense-relatedproteinsinleafthatwereup-regulatedbyTrichodermaΔThph1andΔThph2.
小编心得
本篇是利用高通量蛋白质组学相对定量技术（Labelfree）将前期研究成果深入延续到蛋白质层面，发表在ScientificReports上的文献。该研究为探索木霉属和植物根部相互作用诱导的植物对弯孢属叶斑病的系统耐受性提供了新的认识，描述了木霉菌分泌的纤维素酶Thph1和Thph2的功能，也利用基因敲除法进行了功能验证。构建了木霉菌植物诱导性抗性相关的基因网络调节途径。锁定了该研究中的目标蛋白Thc6的关键调控因子，在研究哈茨木霉诱导玉米ISR的调控机理方面取得了重大突破。可望为今后培育耐真菌感染作物的培育打下理论基础。
中科新生命·质谱系统解决方案专家
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