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高效修复DNA双链断裂需要瞬时RNAD
德国海德堡大学的生物化学中心（BZH）的CorinaOhle等人，年10月在《Cell》（IF=28.71，生物1区）发表了题为“TransientRNA-DNAHybridsAreRequiredforEfficientDouble-StrandBreakRepair”的文章，文章主要内容为：
RNA-DNA杂交体是导致细胞内DNA损伤一个主要因素，其被RNaseH酶降解对维持基因组稳定性很重要。在本文中，我们发现RNA-DNA杂交体和RNaseH酶，在DNA修复时还有意想不到的作用。在裂殖酵母中利用可在特定位点出产生DNA双链断裂（DSB）的系统，我们发现：RNA-DNA杂交体的形成是DSB重组修复过程的一部分，而RNaseH酶对于降解RNA-DNA杂交体和修复的高效完成是必不可少的。敲除RNaseH基因可导致DSB位点处的RNA-DNA杂交体变得更稳定，从而严重影响RPA复合体结合到ssDNA上。相反，如过表达RNaseH1则会破坏杂交体的稳定，导致DNA链过度回切、RPA结合增多，并引起DSB位点附近重复序列的严重丢失。我们的研究是对现有DSB重组模型的挑战，揭示了RNA-DNA杂交体在维持基因组稳定性方面的一个令人惊讶的作用。
真核细胞基因组的完整性不断受到外部因素（例如紫外线、电离辐射以及DNA损伤药物）的挑战。但是它也受到活性氧离子和DNA复制、转录等内部因素的影响。在不同类型的损伤中，DNA双链断裂（DSB）是最有害的，会影响DNA螺旋，且DSB的低效率、不精确修复会造成基因重排、染色体易位和细胞死亡。DSB可以通过两种途径修复：一种是快速的、易错的非同源末端连接（NHEJ）途径，另一种是较为精确的同源重组（HR）途径。在HR修复过程中，在DSB位点会产生DNA单链，复制蛋白A（RPA）结合这些单链并且将其保护起来。
最近数据表明：在DNA修复过程中，非编码RNA（ncRNA）也发挥了作用。在各种生物体中，DSB位点都发现了小的ncRNA。它的作用是指导染色质修饰和其他蛋白质复合体到DSB位点。
RNA逆转录成DNA链对基因组有负面影响。产生的RNA-DNA杂交结构和游离的DNA单链（ssDNA）被称为R环结构。R环对基因组是非常有害的，因为它们能阻止转录和DNA复制，形成DSB。
RNaseH家族的酶能通过切除RNA-DNA杂交结构中RNA部分来降解R环。真核细胞有两种类型的RNaseH酶：RNaseH1是单体，而RNaseH2是由一个催化亚基（Rnh）和两个辅基（Rnh、Rnh）组成的三聚体。RNaseH2能裂解嵌入DNA双链中的单个核苷酸，而RNaseH1至少能裂解4个。在DNA复制过程中，RNaseH除了能降解R环外，也参与了消除RNA引物和错误掺入的核苷酸。
这里，我们发现在酿酒酵母中，RNaseH是DSB高效修复必不可少的条件。敲除RNaseH1和RNaseH2或过表达RNaseH1都会抑制HR介导的DSB修复。使用特定位点DSB系统，我们发现了在DSB位点RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）的聚集和RNA-DNA杂交体的形成。这些杂交体在细胞缺少RNaseH时能稳定存在，也会强烈干扰DSB位点ssDNA-RPA复合体的聚集。过表达RNaseH1却出现相反的结果：消除DSB位点RNA-DNA杂交体、诱导过多的单链切除和RPA被召集到距离DSB位点较远的位点。因此，在过表达RNaseH1时，DSB位点的DNA重复序列就会变得不稳定，特别是影响rDNA位点的高度重复序列。我们的结果表明：DSB位点短的ssDNA片段的出现会诱导PolⅡ转录和RNA-DNA杂交体的形成。这些杂交体参与调控单链切除过程和DSB位点RPA复合体的聚集。随后，需要RNaseH降解RNA-DNA杂交体、保证DSB修复的完成。
1.DNA损伤敏感性分析
2.I-PpoI的切割效率检测
3.I-PpoI或SmaI诱导下生存率检测
4.染色质免疫沉淀(ChIP)
5.ChIP-exonuclease（ChIP-exo）实验
6.qRT-PCR
7.微阵列实验
1、裂殖酵母的DSB重组修复需要RNaseH
2、过表达Rnh1延迟DSB修复
图1.DSB高效修复需要RNaseH
（A）rnh1ΔrnhΔ细胞对DNA损伤高度敏感。酵母野生型（WT）和突变株在诱变剂作用下。CPT（喜树碱），HU（羟基脲），MMS（甲磺酸甲酯），UV（紫外线），YEA（酵母提取物腺嘌呤）是不同类型的DNA损伤试剂。TOP1是编码拓扑异构酶1的基因，RAD52是参与DNA重组修复的关键蛋白，PKU80是参与非同源末端连接的关键蛋白。
（B）通过诱导I-PpoI（一种内切酶）的表达，在酵母基因组含有I-PpoI识别位点的三条染色体上可产生DSB（红线）。ChrⅢ上的切割位点是在含有rDNA重复序列（大约重复序列）处，有多个切割位点。ChrⅡ上的切割位点是人工整合的，同时含有Hph标记基因。
（C）在所有可表达I-PpoI基因的菌株中，诱导其表达后产生的DNA切割效率均类似。切割效率的测定：不诱导（OFF）或诱导I-PpoI表达2hr后，提取菌株基因组DNA进行PCR扩增。引物位于ChrⅡ上的切割位点（CS）两侧，以没有切割点的his3基因作为对照，比较PCR产物，（PCRoverCS）和（PCRuncuthis3），来测定切割效率。对其他的突变株的测定可看图S1B。
（D）诱导I-PpoI表达后，rnh1Δ，rnhΔ和Pnmt1-Rnh1等的生存率比较。诱导I-PpoI表达2hr后，接种到培养基中培养。2天（黑色柱）或4天（灰色柱）后统计菌落数。对于Pnmt1-Rnh1突变株，（+）表示过表达，Rnh1.P值表示双尾t检验值，（**P≤0.01，****P≤0.）。
（E和F）ChrⅡ（E）和ChrⅢ（F，含rDNA重复序列）的I-PpoI断裂位点处的断裂和修复测定。以未诱导I-PpoI的菌株为对照组。诱导I-PpoI表达2hr后，通过移除ahTET（无水四环素）来终止诱导反应（0hr）。在指定的时间点检测修复效率。也可看S1B、S1D和S2A。
3、RNA-DNA杂交体积聚到DSB位点
图2.RNA-DNA杂交体积聚到诱导I-PpoI产生的DSB位点
（A）使用RNA-DNA杂交体的特异性抗体S9.6进行ChIP实验的结果，（+）表示诱导I-PpoI表达2hr；（-）表示未诱导。在rnh1ΔrnhΔ突变株中进行no-antibody和re白癜风山东哪家医院好北京市中科医院好不好
