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PCR实验操作常见问题及解决方法
聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR反应的关键环节有：
①模板核酸的制备；
②引物的质量与特异性；
③酶的质量与特异性；
④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
Q
假阴性，不出现扩增条带，正对照有条带，样品无条带?
可能原因：
1.模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
2.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。
3.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
4.Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
5.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul，或ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
6.物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
7.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
解决方法：
1.纯化模板并重新提取，并检测模板是否含有抑制剂；
2.引物：①选定一个好的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等；
3.优化buffer，摸索镁离子浓度或适当加入DMSO（小于0.3%）；
4.提高退火温度，增加延伸时间。
Q假阳性，空白对照出现条带
可能原因：
1.引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
2.靶序列或扩增产物的交叉污染，这种污染有两种原因：
①整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
②空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
解决方法：
1.实验仪器高压灭菌；
2.实验试剂（酶除外）高压灭菌，离心管枪头一次性使用；
3.规范实验操作；
4.假阳性可通过巢式PCR解决，或者使用特异性较高的试剂盒扩增。
Q出现非特异性扩增带，PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
可能原因：
1.引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
2.Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
3.酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
解决方法：
1.必要时重新设计引物；
2.减低酶量或调换另一来源的酶；
3.降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；
4.适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
Q拖尾、弥散，PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
可能原因：
1.酶量过多或酶的质量差；
2.dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高；
3.退火温度过低，循环次数过多。
解决方法：
1.减少用酶量或使用特异性高的热启动酶扩增；
2.减少dNTP的浓度，适当降低Mg2+浓度；
3.增加模板量，减少循环次数。
QcDNA产量的很低？
可能的原因及解决办法：
1.RNA模板质量低；
2.对mRNA浓度估计过高；
3.反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；
4.同位素磷32过期；
5.反应体积过大，不应超过50μl。
Q产生弥散（smear）条带？
可能的原因及解决办法：
1.在PCR反应体系中第一链产物的含量过高；
2.减少引物的用量；
3.优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数；
4.在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
Q产生大分子量的弥散条带？
可能的原因及解决办法：
1.大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的；
2.对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:-1:）。
Q在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果？
可能的原因及解决办法：
1.通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:、1:0倍以消除DNA污染所造成的影响；
2.有可能是引物二聚体的条带。
Q扩增产物滞留在加样孔中？
可能的原因及解决办法：
1.有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物，建议将第一链结果至少稀释倍再进行二次扩增；
2.另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。
Q为什么得不到RACE产物？
可能的原因及解决办法：
1.加入Hela对照；
2.低质量的RNA模板；
3.逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成；
4.目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR；
5.目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因；
6.目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的OligodT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR；
7.cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
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培训时间年11月22-24日（周四-周六）
培训地点北京●机械工业信息研究院
课程大纲01class模块一：实验室设计建设总体建筑要求时间：11月22日（上午9:00-10:30）实验建筑设计要求：设计依据、总体布局、竖向布局、楼层平面布局、建筑结构02class模块二：理化（通用）实验室的设计建设时间：11月22日（上午10:30-12:00）1.实验室的分类、特点及相关术语
2.理化实验室前期规划和布局（实验室定位、选址基本原则、工艺布局、设备需求分析、实验室装备选型等）
3.理化实验室受控环境要求及实现方法（通风、温湿度、洁净度、供水及排水排污、供电、供气及排气）
4.值得注意的几个问题（楼面活荷载、内门、交通、通风等）
03class模块三：PCR实验室的设计建设时间：11月22日下午（1:30-5:00）PCR实验室设计要求：用房分区、实验室形式、缓冲间与传递窗、平面布局、压力分布、有关误区、案例、关于加样间、高通量测序实验室
04class模块四：微生物实验室与生物安全实验室的设计建设时间：11月23日上午（9:00-12:00）1、微生物和生物安全实验室组成和特点
2、微生物和生物安全实验室设计建设相关法律法规、标准规范
3、微生物和生物安全实验室室内污染和环境控制要求
4、微生物和生物安全实验室设计要点
5、微生物和生物安全实验室工艺平面设计案例
6、微生物和生物安全实验室机电系统设计案例（通风空调、给排水、电气自控、气体供应等）
05class模块五：特殊（专用）实验室的规划设计与建设时间：11月23日下午（1:30-5:00）1.国内外实验室现状（目前国内大多实验室存在的问题）
2.实验室建设场地选择原则和本底条件核查（地质，环境，水电气供应，场地及周边振动、噪声、电磁干扰和射频干扰等核查）
3.实验室规划和空间布局（规划设计理念、实验室标准单元规划、服务走廊和设备管道技术夹层、洁净实验室等布局）
4.实验室室内环境控制及实现方法（温湿度、洁净度、隔振、噪声、接地等受控环境标准和实现方案）
5.公用设施布置（机械系统、电气系统、实验室管道系统）
6.高大空间特殊实验室案例分析（大力值大扭矩实验室、微波天线暗室、医用加速器实验室、全消声室等）
06class模块六：参观典型专业实验室实践课时间：11月24日上午（8:00-12:00）实地参观国家保密单位专业实验室
主讲老师谢景欣
实验与分析平台特约讲师；江苏省疾病预防控制中心职业病防治所书记。
长期从事实验室建设、生物安全和职业健康防护工作与研究。
现任中华预防医学会卫生工程分会副主任委员（兼洁净技术学组组长）、中国微生物学会微生物生物安全专业委员会副主任委员、国家卫计委病原微生物实验室生物安全评审专家委员会委员、中国合格评定国家认可委员会（CNAS）主任评审员、《中国卫生工程学》杂志副主编、国家安全监管总局职业卫生专家、中国卫生监督协会环境卫生与健康专业委员会常务委员等学衔与职务。
主持“十三五”国家重点研发计划、“十二五”国家科技支撑计划重点课题等科研十余项，主持和参编国家和行业标准8部，获自主知识产权7项，主编参编创新专著8部，发表论文50余篇。
曹国庆
实验与分析平台特约讲师，博士，研究员，研究生导师，“十三五”国家重点研发计划项目负责人。
净化空调技术中心副主任、国家建筑工程质检中心净化工程部主任，兼任全国暖通空调学会净化专委会副秘书长、中国合格评定认可委生物安全实验室评审员、中华预防医学会生物安全与防护装备分会委员、中国环境科学学会室内环境与健康分会委员等学术职务。
先后主持/参加国家级科研项目6项，参编国家/行业标准20余项，科研成果获省部级科技奖4项，获得国家发明专利6项，发表论文50余篇，参编著作9项。
长期从事生物安全实验室、理化实验室、医疗洁净用房、医院建筑、医院建筑节能、绿色工业建筑、兽药GMP、室内污染控制、空气洁净技术等领域科研标准、设计咨询、检测验收、调试诊断及产品研发方面的工作。
汪洪军
实验与分析平台特约讲师；中国计量科学研究院实验基地综合管理部副主任（主持工作），高级工程师，注册公用设备工程师
中国合格评定国家认可委员会（CNAS）技术评审员，北京工业大学硕士研究生导师，国家财政部项目评审专家，北京市住建委建设工程项目评审专家，中国电子学会洁净技术分会委员会委员。
作为主要参与人完成国家发改委投资建设项目“中国计量科学研究院实验基地项目”一项，获国家优质投资项目奖。作为主要参与人完成“中国计量科学研究院实验基地二期项目”可行性研究报告，上报国家发改委待批复。作为项目负责人主持完成国家发改委投资建设项目“中国计量科学研究院实验基地精密空调系统安装工程”一项，获中国安装工程优质奖—中国安装之星。作为项目负责人主持完成国家财政部修缮购置类“深冷制造设备”项目一项，获中国计量科学研究院科技进步三等奖。作为项目负责人主持完成原国家质检总局质量技术监督技术改造“中国计量科学研究院昌平院区能耗测评系统的建立”科研项目一项。分别作为第一和第二发明人，获得国家发明专利三项。
在国内外科技期刊公开发表学术论文二十余篇。
培训费用原价：RMB
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三人价：RMB（10月20日后享此价）
差旅自行安排，费用自理
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