干货qPCR引物设计原则

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的-bp区域内，可以用DNAman,Alignment软件看看结果。

产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。

引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。

G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。

碱基要随机分布，尽量均匀，引物自身不能有连续4个碱基的互补，引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物5′端可以修饰，3′端不可修饰，而且要避开AT,GCrich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个），引物3′端要避开密码子的第3位。

引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo6软件进行比对看结果的情况。

引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区，引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。

查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似，TM值在58-62度之间。

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