盘点CRISPRCas9应用近期重大

基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

在CRISPR/Cas9系统中，酶Cas9在DNA靶位点上进行切割，其中这种靶位点是这样确定的：一种被称作CRISPRRNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracrRNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后，借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对，以这种方式，这种嵌合RNA就能够引导Cas9结合到这个靶位点上并进行切割。在实际应用时，人们可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA（gRNA）或者融合在一起形成单向导RNA（singleguideRNA，sgRNA），并被用来引导酶Cas9结合到靶DNA序列上并进行切割，其中Cas9与sgRNA一起被称作Cas9-sgRNA系统。

进一步的研究还证实，CRISPR/Cas9的基因组编辑能力只有在被称作前间隔序列邻近基序(protospaceradjacentmotif，PAM)的短片段DNA序列的存在下才成为可能。只有DNA靶位点附近存在PAM时，Cas9才能进行准确切割。再者，PAM的存在也是激活酶Cas9所必需的。

接下来，小编列举最近一段时间CRISPR/Cas9基因编辑领域取得的重大进展。科学家们利用CRISPR/Cas9技术进行改造，提高其基因编辑特异性，或提高基因编辑通量，或用于治疗疾病，或用于检测不同的病毒毒株，或用于构建疾病模型，或用于对细胞中的内源性蛋白进行标记。

1.Nature子刊：首次利用CRISPR/Cas9在体内成功切除HIVDNA片段

作为一种RNA病毒，HIV是一种逆转录病毒。当感染人细胞（主要是CD4+T细胞）时，它会将自身的RNA逆转录为DNA后插入到宿主基因组中以便进行复制和合成新的病毒颗粒。

在一项新的研究中，来自美国天普大学刘易斯-卡茨医学院的研究人员利用基因编辑技术首次成功地从活的动物基因组中切除HIV-1DNA中的一段序列。这一突破是开发一种潜在地抵抗HIV感染的治疗策略的关键一步。相关研究结果发表在年5月19日那期GeneTherapy期刊上，论文标题为“ExcisionofHIV-1DNAbygeneediting：aproof-of-conceptinvivostudy”。论文通信作者、天普大学刘易斯-卡茨医学院神经病毒学中心主任KamelKhalili博士解释道，“在这项概念验证的研究中，我们证实我们的基因编辑技术能够高效地应用于两种小型模式动物的很多器官中，而且能够将HIV病毒DNA的较大片段从宿主细胞基因组中切除。”

这项最新研究的设计目的是专门测试这种基因编辑技术是否也能够清除转基因大鼠和小鼠体内的HIV-1，其中HIVDNA已被整合进这两种实验性转基因动物的每个器官每个细胞的基因组中。为了让这种基因编辑技术应用于活动物体内的细胞中，Khalili博士和同事们使用重组腺相关病毒（rAAV）载体运送系统。他们也对这种基因编辑系统进行基因改造以便能够切割整合到宿主细胞基因组中的HIV-1DNA，从而导致病毒DNA片段从宿主基因组中切除。

在利用rAAV载体运送系统将CRISPR/Cas-9分子运送到这两种转基因动物的血液中两周后，研究人员分析了从这些动物体内收集的组织中的HIV-1DNA。分析结果证实在包括大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺部和脾脏在内的每个组织中以及血细胞中，HIV-1的特定DNA片段都被从病毒基因组中切除。在分析模式大鼠体内的病毒RNA时，研究人员证实这一策略显着地降低循环淋巴细胞和淋巴结中的HIV-1RNA水平，这就表明病毒基因组片段切除显着地影响携带整合性病毒DNA的细胞中的HIV-1基因表达。

这项新研究的临床影响是深远的。这种基因编辑平台本身可能能够根除病人体内的HIV-1DNA，但是它也是高度灵活的，可能能够潜在地与现存的抗逆转录病毒药物组合使用从而进一步抑制病毒RNA复制。它可能也能够经改造后靶向作用于发生突变的HIV-1毒株。（GeneTherapy，doi：10./gt..41）

2.Nature子刊：利用CRISPR/Cas9清除人T细胞基因组中的HIV-1

人免疫缺陷病毒（HIV）导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS），即艾滋病。在一项新的研究中，来自美国天普大学路易斯-卡茨医学院（LewisKatzSchoolofMedicineatTempleUniversity）的研究人员开发出一种特定的基因编辑系统CRISPR/Cas9，从而为最终治愈HIV感染铺平道路。他们证实利用这种基因编辑系统能够有效地和安全地将这种病毒从在体外培养的人T细胞的DNA中清理掉。相关研究结果于年3月4日在线发表在自然出版集团旗下的ScientificReports期刊上，论文标题为“EliminationofHIV-1GenomesfromHumanT-lymphoidCellsbyCRISPR/Cas9GeneEditing”。

治愈HIV/AIDS---自从上个世纪八十年代首次发现HIV以来，它已夺去了万多人的生命---是HIV研究的最终目标。但是一旦它整合进CD4+T细胞---HIV感染的主要细胞---的基因组后，清除这种病毒已被证明非常困难。近期的努力有意专注于重新激活HIV以便触发强劲的免疫反应从而能够从被感染的细胞中根除这种病毒。然而，在此之前，这些“激活并杀死（shockandkill）”方法中没有一种获得成功。

Khalili博士和同事们决定尝试着一种不同的方法：利用一种独特的定制基因编辑系统CRISPR/Cas9特异性地靶向HIV-1前病毒DNA（整合到宿主细胞DNA中的病毒基因组）。他们的系统包括一种特异性地靶向T细胞基因组中HIV-1DNA的向导RNA（gRNA），和一种切割T细胞DNA链的核酸酶Cas9。一旦Cas9在基因编辑过程中删除HIV-1DNA序列，那么T细胞基因组的松散末端被该细胞自身的DNA修复机制重新连接在一起。

在这项新的研究中，他们着重研究HIV潜伏地和有效地感染的人CD4+T细胞，并证实这种技术不仅将这种病毒从T细胞中清除，而且在HIV-1已被根除的T细胞中，这种系统的持续存在阻止它们再次感染。更为重要的是，他们在体外开展实验，先将来自HIV感染者的T细胞在体外进行培养，随后证实利用这种基因编辑系统处理这些T细胞能够抑制病毒复制和显着地降低病人T细胞中的病毒载量。（ScientificReports，doi：10./srep）

3.Cell：利用CRISPR/Cas9系统精确标记发育大脑中的内源性蛋白

在一项新的研究中，来自美国马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所（MaxPlanckFloridaInstituteofNeuroscience，MPFI）的RyoheiYasuda博士和他的团队开发出一种被称作SLENDR的方法，这种方法允许对活组织样品中的神经元DNA进行精确修饰。利用这种新技术，研究人员能够可靠地在同一个细胞中利用不同的颜色同时对两种不同的蛋白进行标记。他们利用多种成像方法和DNA测序证实这种SLENDR方法真正地和准确地敲入基因。相关研究结果于年5月12日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“High-Throughput，High-ResolutionMappingofProteinLocalizationinMammalianBrainbyInVivoGenomeEditing”。SLENDR的全称为CRISPR/Cas9介导同源重组修复对内源性蛋白进行单细胞标记（single-celllabelingofendogenousproteinsbyCRISPRCas9-mediatedhomology-directedrepair）。

尽管CRISPR系统强大的基因编辑能力让人印象深刻，但是它很少在操纵脑细胞DNA中取得成功，这是因为在大脑形成时，它的细胞不再分裂。尽管科学家们能够利用CRISPR相对容易地敲除大脑中的某些基因，但是细胞分裂的缺乏使得他们很难通过HDR可靠地和精确地敲入所需的基因。

为此，Yasuda和他的团队开发出一种他们称之为SLENDR的方法，该方法能够被用来准确地修饰活组织样品中的神经元DNA。在实验性模型中，研究人员选择子宫内电穿孔技术，该技术允许他们将CRISPR/Cas9系统插入到仍然在发育和分裂的胎儿期脑细胞中。因此，发生断裂的DNA仍然通过HDR进行修复，这就允许研究人员导入一种能够在显微镜下可视化观察感兴趣蛋白的基因。他们甚至能够可靠地在同一个细胞中利用不同的颜色同时对两种不同的蛋白进行标记。他们利用多种成像方法和DNA测序证实这种SLENDR方法真正地和准确地敲入基因。

在测试这种新技术时，研究人员观察到蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）α亚型的一种之前未曾描述的行为。在发育早期，大约在出生7天后，PKCα亚型被发现在神经元细胞膜中簇集，这提示着它是高度有活性的，然而在出生一个月后，它在整个神经元中广泛地扩散，这提示着在发育后期，它不再是高度有活性的。（Cell，doi：10./j.cell..04.）

4.Cell：开发出低成本的基于CRISPR/Cas9的纸片诊断系统快速检测寨卡病毒

在一项新的研究中，一个由多个机构组成的由美国哈佛大学维斯生物启发工程研究所（WyssInstituteforBiologicallyInspiredEngineering）合成生物学家JamesCollins博士领导的国际小组开发出一种低成本的基于试纸的快速诊断系统，该系统能够毒株特异性地检测寨卡病毒（Zikavirus，ZIKV），而且它可能很快被用来在现场筛查血液、尿液或唾液样品。相关研究结果于年5月6日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Rapid，low-costdetectionofZikavirususingprogrammablebiomolecular







































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