倒计时66天最后一节生化知识点

今天是生物化学最后一节了，明天就将开始错题复习，同学们可要认真复习哦，生化在枯燥也不可轻易放弃。

真题回顾

目前基因治疗主要采用的方式是。

A.对患者缺陷基因进行重组

B.提高患者的DNA合成能力

C.调整患者DNA修复的酶类

D.将表达目的基因的细胞输入患者体内

真题解析

基因治疗是通过一定方式将人正常基因或由治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。

基本程序有：选择治疗基因、选择携带治疗基因的载体、选择基因治疗的靶细胞、在细胞和整体水平导入治疗基因、治疗基因表达的检测。

将治疗基因导入人体的方法有两种：

间接体内疗法，即先靶细胞从体内取出，在体外培养，将携带有治疗基因的载体导入细胞内，筛选出接受了治疗基因的细胞，繁殖扩大后再回输体内。D正确。

直接体内疗法，即将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。

答案选D。

考点讲解

这部分内容八版改动较大，重组DNA技术在第21章进行了具体论述，而其应用则出现在第24、25章。

一、基因重组

DNA重组是指不同DNA分子断裂和链接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。自然界的NDA重组和基因转移方式有多种，包括同源重组、位点特异性重组、转座重组、接合、转化和转导等。

1.同源重组是最基本的DNA重组方式

（1）概念

同源重组指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。

（2）四个关键步骤

两个同源染色体DNA排列整齐；

一个DNA的一条链断裂，并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；

通过分支移动产生异源双链；

Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。

2.位点特异性重组是发生在特异位点间的DNA整合

由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。

3.转座重组可使基因移位

大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一个位置，这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子，由插入序列和转座子介导的基因移位或重排，就是转座重组。

4.原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组

（1）接合作用

当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可以从一个细胞（细菌）转移到另一细胞（细菌），这就是接合作用。

（2）转化作用

通过自动获取或人为地供给外源DNA，使受体细胞获得新的遗传表型。

（3）转导作用

当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。

二、重组DNA技术

1.常用工具酶

（1）限制性核酸内切酶

识别特异序列，切割DNA。

（2）DNA连接酶

催化DNA中相邻的5-磷酸基和3-羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。

（3）DNA聚合酶Ⅰ

合成双链cDNA分子或片段连接，缺口平移法制作高比活性探针，DNA序列分析，填补3-端。

（4）Klenow片段

常用于cDNA第二链合成，双链DNA3-端标记。

（5）逆转录酶

合成cDNA，替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补、标记或DNA序列分析。

（6）多聚核苷酸激酶

催化多聚核苷酸5-羟基末端磷酸化，或标记探针。

（7）末端转移酶

在3-羟基末端进行同质多聚物加尾。

（8）碱性磷酸酶

切除末端磷酸基。

2.常用载体

（1）克隆载体

特点：至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；至少有一个选择标志；有适宜的RE的单一切点。

常用克隆载体：质粒、噬菌体DNA。

（2）表达载体

原核表达载体以大肠杆菌表达载体应用最广泛。

真核表达载体蛀牙分为酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳类细胞表达载体。

三、基本原理及操作步骤

1.目的基因的分离获取——分

化学合成法、从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA、PCR法、其他方法（利用酵母单杂交系统或酵母双杂交系统）。

2.载体的选择与构建——选

目的有获得目的DNA片段（选克隆载体）和获得目的DNA片段所编码的蛋白质（选表达载体）。同时还需要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素。

3.目的DNA与载体连接——接

（1）黏端连接

依靠酶切后残余的黏性末端进行连接是反应效率较高，也是方向性和准确性较强的连接。

（2）平端连接

如果目的DNA两端和线性化载体两端均为平端，则两者之间也可在DNA连接酶的作用下进行连接，但连接效率都较低。

（3）黏-平末端连接

黏-平末端连接是目的DNA和载体之间通过一端为黏端，另一端为平端的方式进行连接，连接效率介于黏端链接和平端连接之间。

4.重组DNA转入受体细胞——转

（1）转化

将重组质粒转化进入大肠杆菌进行扩增是最常用的策略。

（2）转染

将外源DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程。

（3）感染

以噬菌体载体或黏粒载体构建的重组DNA分子，可通过包装形成病毒颗粒，然后以感染的方式将重组DNA转入受体菌。

5.重组体的筛选与鉴定——筛

（1）借助载体上的遗传标志进行筛选

包括了利用抗生素抗性标志筛选、基因的插入失活/插入表达特性筛选、标志补救筛选、噬菌体的包装特性筛选四种方法。

（2）序列特异性筛选

包括RE酶切法、PCR法、核酸杂交法、DNA测序法等。

6.克隆基因的表达

四、重组DNA技术在医学中的应用

基因治疗，就是向有功能缺陷的细胞导入具有相应功能的外源基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。

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