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人上了年纪，病毒就开始嚣张
血液中巨细胞病毒载量与年龄的关系
巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）是疱疹病毒的一种，原发感染后在人体内会维持终身潜伏的状态。随着患者年龄的增加CMV的感染率呈现上升的态势，大于5岁的人群中，CMV血清阳性的范围在50%~95%。正常情况下，CMV感染者体内病毒的复制被体液免疫和细胞免疫所控制。但目前发现，CMV血清阳性感染者随着年龄的增加免疫系统功能的加速减弱，从而引起一系列CMV相关的并发症，增加了老年患者的死亡率。
虽然CMV原发感染后一般不会引发显著的临床症状，但是由于病毒的复制而导致的亚临床反应还是经常发生，好在这种水平的病毒复制一般被人体强大的免疫系统所控制。为了更好地了解CMV感染对老年人健康的影响，首先必须明确血液中CMV载量的变化，在此基础上才能进一步深入了解CMV相关的免疫反应。
人体内CMV主要的潜伏宿主细胞有：造血干细胞、单核细胞和上皮细胞等，其中单核细胞是病毒的主要宿主细胞类型。但健康人血液内的CMV载量非常低，采用PCR类检测方法结果往往是阴性。PCR检测结果呈阳性意味着病毒的复制水平显著上升，临床上可以考虑抗病毒或免疫调节治疗。本期介绍英国伯明翰大学的研究，采用能实现绝对定量的微滴式数字PCR技术对健康人血液中CMV载量进行了分析，发现70岁以上老年人血液中病毒的载量显著上升。
测试样品及主要检测方法
1
总共44名健康的志愿者，年龄范围：25~86岁，ELISA检测结果为阳性。每名志愿者提供50ml全血，其中血浆进行ELISA检测，PBMCs进行T细胞功能分析和单核细胞核酸纯化后的病毒定量。另外5名志愿者作为外周血干细胞提供者。
2
对CD14+,CD16+,CD34+和CD14+/16+细胞采用MoFLow进行分选。
3
微滴式数字PCR（QXdropletdigitalPCRSystem）。利用FAM标记的探针检测CMV的载量，HEX标记探针检测RPP30的拷贝数，最后计算得到每个单核细胞内CMV的拷贝数。
4
荧光定量PCR（RealTimePCRSystem）。采用与数字PCR相同的引物和探针进行病毒载量的测定，与数字PCR不同的是：在检测中引入了标准品，并进行3次重复。对于样品的检测，3个重复孔都是阳性的情况下该样品才被判定为阳性。
5
ELISA：分析血液中CMVIgG的滴度。
结论
1
微滴式数字PCR可以实现单核细胞中CMV的检出：在44名志愿者的单核细胞中共测得16例阳性，并经过三次重复检测的确认，具体结果见下图a部分。
2
单核细胞中CMV载量随年龄增加显著上升：在37名70岁以下的志愿者中仅检测出9名阳性患者（24%），而7名70岁以上志愿者中的检出率为%，具体结果见下图b部分。由于ddPCR对CMV可进行绝对定量，因此可以计算得到CMV拷贝数/十万个单核细胞。70岁以下志愿者的CMV平均载量为8.6/十万个单核细胞，70岁以上志愿者的CMV平均载量为/十万个单核细胞，增加了29倍，具体结果见下图c部分。
3
荧光定量PCR方法对数字PCR结果的验证：数字PCR的16例阳性结果中，qPCR确认了其中的13例；数字PCR的28例阴性结果中，qPCR确认了其中的27例。以两种方法都确认为阳性的13例结果分析显示：ddPCR和qPCR的R^2=0.(p=0.)。
4
CMV存在于CD34+的造血干细胞和CD14+单核细胞内：利用流式分选技术分选得到不同的细胞亚型，结合ddPCR和qPCR的分析发现：CMV主要存在于CD34+的造血干细胞和CD14+单核细胞内，在CD+16细胞内几乎不存在。具体结果见下图c部分。
5
CMV特异性IgG的滴度也随着年龄增加上升：采用ELISA分析发现，80岁年龄组CMV特异性IgG的滴度是20岁年龄组的3倍，且随年龄增加抗体滴度的上升呈现线性增长趋势，与病毒载量随年龄增加呈指数增长的方式不同。具体结果见下图。
6
T细胞对pp65和IE-1抗原的细胞免疫水平与年龄的关系：对于pp65抗原，CD8+和CD4+T细胞的细胞免疫水平均随着年龄的增加而上升；对于IE-1抗原，CD8+T细胞的细胞免疫水平在50~60岁时达到峰值，随后开始下降，CD4+T细胞的细胞免疫水平保持恒定。具体结果见下图。
讨论
01
随着免疫系统功能的逐步减弱体内CMV的水平逐渐增加，70岁后迅速上升。但是病毒载量上升的具体模式还不明确：究竟是单个受感染单核细胞内病毒载量增加还是受感染单核细胞比例的上升？
02
与HIV研究类似，能够直接测定CMV的绝对拷贝数对于理解病毒与宿主免疫水平之间的关系非常关键。下图给出了CMV载量与免疫系统的平行变化关系。首先，CMV载量在70岁后呈快速上升趋势；其次，虽然总免疫球蛋白水平会随着年龄增加而下降，但是CMV特异性的抗体水平与CMV载量呈同向上升趋势，这表明体内免疫功能的下降并非CMV载量上升的主要原因；最后在细胞免疫水平上，针对IE-1抗原的CD8+T细胞在50~60岁时达到峰值，随后开始下降，也许细胞免疫功能的下降是CMV载量增加的主要原因。
下期
预告
数字PCR对病毒的检测，能否再“直接”一点
封面图片来自陈斯卡。
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