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水稻中环状RNA的全转录组研究
circRNA作为一种非编码RNA，在动物特别是人中的研究比较多，但在植物中的研究非常有限。植物中的circRNA是否和动物具有相同的特质、发挥相似的调控作用？文章以水稻Oryzasativa为研究目标，进行了全基因组范围circRNA的鉴别，并对其特性进行了分析。
摘要：
CircRNAs，作为竞争性内源RNA（ceRNA）或其亲本编码基因的正调节子，在调控miRNA功能和转录中起重要作用。然而，植物中的circRNAs知之甚少。本文通过深度测序和ssRNA-seq（链特异性RNA测序）数据的计算分析，报道了个circRNAs，在水稻中普遍存在。其中个是外显子circRNAs。一些circRNAs组织特异性表达。水稻circRNA有大量的异构体，包括反向剪接和可变剪接环化。具有多个外显子的亲本基因优先被环化。只有个circRNAs在已知剪接位点发生反向剪切。只有92个circRNA在侧翼序列中富集了微型反向重复转座元件（MITE），或与至少18-bp的侧翼区的内含子序列互补，表明水稻中除了反向剪接还有其他产生circRNA的机理。水稻circRNA没有显著富集miRNA靶位点。转基因研究表明，与空载体对照植物相比，circRNA过表达的构建体可以降低转基因植物中亲本基因的表达水平。表明circRNA及其线性形式可能作为亲本基因的负调节器。
材料与方法：
植物材料：
栽培水稻粳稻日本晴的种子，30℃下在培养箱中发芽。在开花时收获穗和成熟叶，提取RNA。
方法：
1、基因组DNA、总RNA提取和RNaseR处理：
2、PCR扩增和Sanger测序：
3、半定量和定量实时PCR：
4、ssRNA-seq（链特异性）文库制备和Illumina测序：
5、全长cDNA文库制备和PacBioRSII测序：
6、Reads比对及分析：
7、预测水稻circRNAs中作为miRNA目标模拟物：
结果：
1、水稻中circRNA的鉴定
测序共产生MPEreads。
从水稻中的poly（A）+和poly（A）-ssRNA-seq数据中鉴定了个唯一比对的circRNAs。
（A）circRNA的鉴定流程图。
（B）估计灵敏度和错误发现率。
（C）水稻叶和穗的poly（A）+mRNA和poly（A）-mRNA样品中检测到的circRNA的维恩图。
（D）水稻circRNA的基因组来源。
2、各种实验策略验证水稻circRNAs。
（A）水稻环状RNA（以Os09circ为例）的验证策略。
（B）反向引物在cDNA中成功扩增了三个circRNA，但在基因组DNA中没有扩增。
（C）qRT-PCR显示8个circRNA在RNaseR（-）和RNaseR（+）的总RNA样品中都稳定表达，而线性对照在RNaseR（+）样品中不表达。
（D）RT-PCR进一步显示11个circRNA是RNaseR抗性的。一些circRNA显示组织特异性表达。
（E）根据ssRNA-seq数据和RT-PCR总结的30个circRNA在叶和穗聚（A）-和聚（A）+样品中的表达结果。
3、水稻三个可变剪接环化事件的可视化和验证。
（A）叶和穗中的circRNA“Os10circ”用反向引物进行PCR扩增。通过Sanger测序进一步证实了反向剪接位点。
（B，C）与A类似，显示PCR扩增和Sanger测序的结果。鉴定和验证了可变的反向剪接环化事件。
4、分析转基因水稻植物中circRNA“Os08circ”的过表达。
（A）Os08circ的环化结构及其亲本基因（AK）的可视化。
（B）Os08circ过表达转基因株系和空载体转基因株系的qRT-PCR结果。
（C）qRT-PCR结果显示，与空载体转基因植物相比，Os08circ过表达转基因植物的叶和穗组织中Os08circ亲本基因AK的表达水平大大降低。
（D）叶和穗中过表达转基因系和空载体转基因系之间的DEG的功能分类。
亮点分析：
1、首次对植物中的circRNA进行全基因组鉴定和功能分析，表明circRNA在稻中是普遍的并稳定表达的。
2、推测circRNAs及其线性形式可能充当亲本基因的负调节剂。
参考文献：
Transcriptome-wideinvestigationofcircularRNAsinrice.
RNA..IF=4.
