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RPA引物筛选及设计原则

RPA引物筛选及设计原则：RPA最长可扩增bp左右长度，但取决于反应条件。标准的AMP试剂盒对反应速度进行了优化，目的片段只适合低于bp的扩增子，最适-bp左右，最低70-80bp左右。

　　RPA的引物筛选主要分为以下几步：选择靶标区域，设计候选引物，筛选候选引物，提升性能再次筛选。引物筛选的条件最好尽量模拟实际检测时的条件，例如模板的拷贝数、样本纯度等等。还取决于你对检测灵敏度的要求。举例来说，如果目标分子上千，那么绝大多数引物都够用了。对灵敏度要求很高的话，最好是进行系统性的引物筛选。一开始筛选的时候，候选引物可以有10到20对。测试的引物越多，找到好引物的几率也就越大。

　　RPA引物设计原则：

　　15’端3到5个核苷酸避免聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，能促进重组;

　　23’3个核苷酸是G或C有助于聚合酶的稳定性;

　　3不要出现聚嘌呤和嘧啶;

　　4GC含量在30-70%之间避免形成二级结构，发卡结构等;

　　5靶标区域避开重复元件。

　　推荐阅读：新一代RPA恒温扩增荧光检测仪T8

　　探针相关问题解答：

　　筛选引物的时候必须用探针么?

　　不一定。任何检测方法都可以用来评估候选引物的性能。不过对于筛选高灵敏度引物来说，用检测探针对扩增进行实时监控被证明是最快也最省力的方法。

　　RPA反应需要用多少探针?

　　RPA反应一般每次需要nM探针。不过，略微改变探针的浓度有时会促进反应的进行。我们可以在一定浓度范围内(从50nM到nM)，根据自己的具体应用对探针进行优化。