实验技术PCR结果不太好来这里找找

PCR常见问题

聚合酶链式反应（PCR）作为一项体外特异性扩增DNA的实验技术，在分子生物学研究中扮演着极其重要的角色。然而在日常实验中，并不是每次PCR反应都能得到满意的结果，总是会多多少少出现一些问题。下面就PCR中经常出现的问题做一个简单总结，以期能为大家今后的实验提供一点帮助。

扩增不出条带，假阴性

扩增不出条带的原因有多个，在保证PCR加样过程、仪器、PCR反应体系没有问题的情况下，考虑以下几个原因：

1模板

考虑模板质量是否出现问题，是否降解；是否含有杂质及酶抑制剂等。

2酶

酶活性是否丧失。

3引物

引物本身的质量及上下游引物的浓度是否对称；设计的引物过短，不能与单链DNA结合。

除以上原因，反应体系中的退火温度也是影响PCR扩增效率的重要因素，退火温度不要太低，太低会导致非特异性扩增；也不要太高，太高会影响引物与模板DNA的结合。下图从左至右，泳道1为Maker、泳道2条带扩增失败、泳道3非特异性扩增且无目的条带。

假阳性

假阳性指扩增出的条带并非想要的目的条带，问题在于扩增序列与非目的序列之间有同源性，需要重新设计引物，增加引物长度。可以考虑使用巢式PCR。

出现非特异性条带

1扩增过程中引物之间形成引物二聚体，解决办法为适当减少引物量。

2退火温度过低，出现非特异性扩增，可以设置梯度筛选最佳退火温度。

3减少酶量，减少循环次数等。

条带不规则整齐

1条带呈现波浪状，出现这种情况的原因多半是由电泳时电压过大引起的。

2条带呈拖尾或弥散状，这种情况可能是由于点样过程太慢，导致原液在点样孔中停留时间太久；点样过多；还有就是电压要合适。

如图就是条带弥散。

胶很白，条带不亮

出现这种情况的原因是在煮胶的时候不充分，胶没有完全溶解；DNA染料加的太多。对策：在煮胶的时候最好不要用高火，用中高火或者中火慢熬，使琼脂糖完全溶解于缓冲液之中；DNA染料不要加太多，goldview每ml缓冲液加1ul即可。对比看下图

以上是对PCR过程中出现的一些问题的总结，欢迎提出修改建议！