荐读有效分离鉴定牛奶中金黄色葡萄球菌及案

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作者：张志超，王晓，俞英

摘要：本文采用金葡菌选择性培养基、酶解法及特异性基因扩增等方法，对采自北京，河北和新疆的25头份临床乳房炎奶牛的奶样进行金黄色葡萄球菌（金葡菌）分离、基因组提取和Nuc基因鉴定。结果分离鉴定出8株阳性金葡菌，分属于6份样品，金葡菌检出率为24.0%。本研究为所检测牛场防范金葡菌的传染提供可靠的检测结果和建议。

关键词：临床乳房炎；牛奶；金葡菌；分离与鉴定

随着科学与技术的不断发展，奶牛的产奶性能得到了不断提高，但乳房炎问题也越来越严重，严重危害了奶牛养殖业的发展。在挤奶过程中，乳头管扩张，致病菌很容易侵入乳头内，并在乳腺中繁殖、释放毒素，进而引发乳房炎。

金黄色葡萄球菌（S.aurus，以下简称金葡菌）是主要的乳房炎致病菌之一，并且一旦感染很难从奶牛体内彻底清除，如果在牛群中开始传播更会造成不可估量的损失。因此，对乳房炎牛进行金葡菌的鉴定就变得异常重要，一旦发现金葡菌阳性牛能及时采取措施，以防出现更大的损失。而通过对临床乳房炎牛的奶样进行金葡菌的分离和鉴定是一种准确而且对牛的应激也较小的方法。

本文使用胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）高盐溶液（NaCl浓度，7.5%）和Baird-Parkr琼脂基础（BP）结合对牛奶中的细菌进行金葡菌的筛选，根据生化指标进行初步选择；鉴于Nuc基因是金葡菌的特异性致病基因，通过提取初步选择的菌落的基因组，对Nuc基因进行特异性PCR扩增来最终确定该牛奶样品是否为金葡菌阳性。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂和仪器

胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），缓冲蛋白胨水（BPW），Baird-Parkr琼脂基础（BP），亚碲酸盐卵黄增菌液，氯化钠，LB肉汤，丙三醇，异丙醇，Wizard?GnomicDNAPurificationKit（Wizard?基因组DNA纯化试剂盒），pH=8.0的EDTA溶液，溶菌酶（Lysozym），溶葡萄球菌酶（Lysostaphin）。

50ml无菌离心管，1.5ml离心管，无菌一次性平板，不同型号锥形瓶，烧杯，玻璃棒，不同大小移液枪和枪头，菌种保存管，PCR仪琼脂糖凝胶电泳设备，凝胶成像系统，Nanodrop，摇床，培养箱，金属浴，生物安全柜，离心机，接种针，接种环。

1.1.2试验对象

从北京、河北和新疆某牛场无菌法采集25头份临床乳房炎奶牛的新鲜奶样。采集奶样方法：先药浴四个乳区，用灭菌纸巾擦干净，再用棉花蘸取75%的酒精对四个乳头擦拭，包括四个孔区，最后挤掉前三把奶用无菌的离心管收集所需奶量。

1.2方法

1.2.1BPW增菌

按说明配制一定量的BPW溶液并高温高压灭菌（℃，20min），冷却后在生物安全柜中取30ml到无菌的50ml的离心管中，再加入3ml奶样，37℃摇床rpm培养18-24h。

1.2.2TSB选择性培养

取30ml氯化钠浓度为7.5%的TSB溶液加入无菌的50ml离心管，再加入3ml增菌后的菌液，37℃摇床rpm培养18-24h。

1.2.3BP培养基初步鉴定金葡菌

按要求配制BP培养基，高温高压灭菌后，每95mlBP加入5ml亚碲酸盐卵黄增菌液，充分摇匀后倒入平板中，冷却凝固后备用。将TSB选择培养后的溶液用接种环蘸取，三线法划于BP平板，37℃培养箱中培养18-24h后选取生化特征明显的菌落进行增菌，提取细菌基因组进行进一步确认。

1.2.4金葡菌基因组提取

将疑似菌落用枪头挑入装有5mlTSB溶液的50ml离心管中，吹打混匀，37℃摇床rpm培养过夜。金葡菌基因组采用酶解法提取，其具体步骤参照Promga细菌基因组提取试剂盒描述。

1.2.5DNA浓度检测

用Nanodrop核算分析仪对提取的金葡菌基因组浓度和纯度进行检测。

1.2.6PCR扩增特异的Nuc基因

对疑似菌落进行Nuc基因特异性扩增，引物序列：R：GCGATTGATGGTGATACGGTT；F：AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC，扩增片段为bp，PCR产物通过2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。使用25ul体系（模板3ul，上游引物R1ul，下游引物F1ul，Prmix12.5ul，dd水7.5ul）。

2结果

2.1BP培养基培养结果

细菌在经过TSB高盐溶液选择培养后，三线法划在BP平板上培养18-24h后，根据金葡菌菌落在BP上的生化特征进行选择。选取标准如图1A中箭头所示，即选择带明显晕环的菌落进行特异基因的PCR扩增。

图1金葡菌培养形态（A）及其特异基因Nuc的电泳检测图（B）

注：A图箭头所示为金葡菌晕环；B图分子量标记后的8个泳道为8株金葡菌的Nuc基因扩增条带（bp）

2.2Nuc基因鉴定结果

本次试验的25头份奶样中有6头份含有符合图1A特征的菌落，选取其中8个菌落进行增菌，提取其基因组DNA，再进行Nuc基因的特异性PCR扩增及鉴定。电泳结果如图1B所示。

据图1B可知，所选取的8株细菌都检测到金葡菌特异基因Nuc，表明均为金葡菌。这些菌株分属6头份奶样，其中有1份样品来自北京，金葡菌阳性率为14.3%；4份样品来自河北，阳性率为40.0%；1样品来自新疆，阳性率是12.5%（表1）。

表1临床乳房炎牛新鲜奶样金葡菌检出情况

3讨论及分析

关于金葡菌基因组DNA提取方法，王晓等在制作金葡菌模板时使用煮沸法，这种方法所能破坏的金葡菌细胞很少，金葡菌基因组DNA提取量少，因此扩增效果相对低。本文所采用的酶解法提取的金葡菌基因组质量较高，浓度可达ng/uL至2ng/uL；纯度较高nm/nm及nm/nm比值均达1.8～2.0，能充分满足金葡菌特异基因的检测和后续相关分析。

关于奶牛乳样的金葡菌检出率，王晓等文献中报道北京两个荷斯坦牧场的金葡菌检出率分别为7.3%和12.5%，安晶等对中国北方3个地区荷斯坦牧场的大罐奶和临床型乳房炎奶样的金葡菌检出率为16.5%，都明显低于本文24.0%的检出率。原因可能是本文所检测奶样全部来自临床乳房炎牛，而王晓和安晶等研究中约一半样品来自生产群奶牛。结果提示，临床乳房炎牛的金葡菌检出率高。

综上，本文建立的金葡菌基因组提取法及Nuc基因检测方法，是一种更细致准确的金葡菌鉴定方法，能非常准确灵敏地鉴定出牛奶中是否有金葡菌感染，为奶牛场防范金葡菌的传染提供可靠的指导，通过及时处置隔离金葡菌阳性牛，使金葡菌感染造成的损失降到最低。

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