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第一章掌握这8点令PCR引物设计事半功
临门一脚，先讲核心，掌握核心，引物设计任你驰骋。
引物长度
引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响，最终影响到PCR反应是否成功。多数情况下，引物长度约18~30bp,引物太短会导致非特异扩增，太长虽然会增加特异性，但是二级结构（如发夹结构）出现的概率增大。
引物的解链温度
PCR反应的特异性很大程度上依赖于引物的解链温度（Tm值）。多数PCR反应最优的解链温度应在55~60℃，如果没有其他不稳定因素，引物的Tm值取决于它的长度、序列组成和浓度，离子强度的影响可以忽略不计，因为不同的PCR反应盐浓度变化不大。
一个反应中所有引物的解链温度应尽可能接近。对于多数PCR反应而言，引物之间的差应小于2~3℃。差值增大，反应效率会降低，甚至直接导致反应失败。因为Tm值髙的引物在低于退火温度的条件下错配，而Tm值低的引物在髙于退火温度的条件下与模板只有低浓度结合。
可利用以最近邻热力学理论为基础的公式估算Tm值，该理论分析了复式解链的热力学过程。
Tm=[△H/△S-RIn(c)]-.15（公式1）
复式构成物中焓变（△H）和熵变（△S）可借助于最近邻热力学参数计算，为摩尔气体常数，c为寡核苷酸的物质的量浓度。该分析可确定特定的焓和熵对复式构成物的自由能的影响，该影响由序列中的「最近邻」造成。最近邻从5末端起始，焓和熵的效应是加性的。在式（1）中加人另一个条件，以经验性地计算盐对复式构成物的稳定性的影响。
Tm=[△H/△S+RIn(c)]-.15+12.0lg[Na+]（公式2）
大多数引物设计软件都使用Breslaner或SntaLucia最近邻参数系统估算寡核苷酸复式构成物的Tm值（Breslaueretal.;SantaLucia)。
对于由20个或更少个碱基组成的短序列，可用Wallace原理计算其第一位近似值。该公式假定盐的浓度为0.9mol/L，这是斑点杂交分析的常用浓度。
Tm=2℃*(A+T)+4℃*(G+C)（公式3）
一般来说，退火温度比引物解链温度低5°C。但是，根据这一原则得出的退火温度常常并不是最优的，必须通过实验获得最优温度。利用梯度热循环仪很容易实现这一目的。另外，可利用更精确的公式计算乃值（最优退火温度）（Rychliketal.)。
Ta=0.3*引物Tm值+0.7*产物Tm值-25（公式4）
复制子的解链温度
除了计算引物的解链温度以外，还要保证产物的解链温度要足够低，以保证其在92℃时完全解链。一般来说，~bp的片段可以有效扩增。该参数有助于使PCR效率更高，但并不总是成功的PCR所必需的。产物的Tm值可根据（式5）计算。
Tm=81.5+16.6*(lg10[K+])+0.41(%G+C)-/长度（公式5）
二级结构
设计引物时，另一个需要考虑的重要因素是二级结构的存在。一个带有自身同源序列的引物可以回折形成部分双链的发夹结构。类似地，引物之间的同源可能引起引物二聚体的形成。PCR反应时，相对于模板而言，引物浓度髙很多，引物之间相互退火要比引物与模板之间退火容易得多。因此，引物如果存在发夹结构或者二聚体，对于PCR扩增往往是致命的，因为这样会导致非特异的大量背景产物的扩增。避免出现二级结构的最简单的方法是：选择GC含量约50%、四种碱基中缺少一种的引物。
重复
同一碱基或几个核苷酸的重复也应尽量避免。不同的重复对PCR反应的影响见表1。
GC夹
在引物的3端包含一个G或C残基可增加引物扩增效率，这就是所谓的「GC夹」。它可以促进引物的3端正确地结合到模板，因为GC夹可以形成更为稳定的氢键，因此可以提髙扩增的特异性。以胸腺嘧啶结尾的引物的特异性有降低的趋势。
高GC含量片段的扩增
为了扩增高GC含量的DNA，应该设计Tm值（最好为75~80℃)较高的引物。髙GC含量的DNA双链完全解开所需的温度明显较一般的DNA高。温度较低时，PCR复制子的两条单链有较快地重新退火的趋势，可与引物退火相互竞争。因此，PCR过程中退火温度较髙有助于引物退火，因此可以提髙扩增效率。
非目标同源
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