中国是如何识破双面间谍斯诺登骗局的

斯诺登这事来的太唐突，考虑到国际影响和各方态度，中国权衡再三下并没有同意斯诺登的入境，并顺水推舟把斯诺登这个烫手山芋扔给了俄罗斯。斯诺登事件，由最初针对中国，并测试全球对美国忠诚度的骗局，在中俄联手下演变成了一场让美国出糗的闹剧。如果计划一旦成功，斯诺登提供的大量伪造数据将对中国造成重大国际战略误判，同时美国也会给中国施加巨大的外交军事压力，如果斯诺登演的足够好还能成功打入中国国家安全系统，对中国国家安全进行深入破坏。

爱德华·斯诺登近期再次成功占领各方舆论焦点。这一次，他不再是揭秘美国的各种所谓的黑暗秘密了，而是在接受节目访问时向全世界表明，他有意愿与华盛顿达成协议回到美国，即使面临牢狱之灾。这场牵动全球，戏弄了绝大多数人的骗局，似乎很有可能将于近期落下帷幕。然而，事实是否果真如此？

斯诺登事件后各国反应

斯诺登离开香港前往俄罗斯后，还向俄罗斯、中国、印度等27个国家提交避难申请。部分国家对斯诺登的请求做出了回应：

俄罗斯：俄罗斯接受斯诺登避难申请的前提是他停止对美国的“伤害”。

中国：没有有关斯诺登申请政治避难的消息。

委内瑞拉：已准备好为斯诺登提供政治庇护。

印度：找不出任何理由接受斯诺登的申请。

挪威：不许从国外递交避难申请，应在挪威国土申请避难，斯诺登的要求将被驳回。

德国：此事无关人权保护。

法国：不是很重要的问题。

波兰：不会对申请给予“积极建议”。

芬兰：不会受理斯诺登避难申请。

瑞士：斯诺登必须从瑞士国土提出避难申请。

巴西：斯诺登的避难请求“不正式”且“不严肃”。

各国反应要数俄罗斯的反应最为值得玩味。与美国每每对着干的战斗名族居然会说俄罗斯接受斯诺登避难申请的前提是他停止对美国的“伤害”。这的确让人不解。

事实上整个斯诺登事件疑点重重：

第一、美国对于国家安全的重视是出名的，他们的安全部门怎么会犯下如此大的疏忽，竟然让斯诺登带着四台涉密笔记本及硬盘逃离美国？

第二、为什么事发时斯诺登要选择香港？这里恰巧是临近中国与俄罗斯的地界，让人不得不联想，斯诺登本身已经想好了前往中国或者俄罗斯的准备，这个选择有着明显的目的性和计划性。

第三、斯诺登自称自身多携带的秘密载体，然而为何要给于英国卫报，而英国卫报最后在来自政府通信总部的技术人员的监视下，被角磨机和其他工具所弄碎？　

第四、当斯诺登在俄罗斯进退两难之际，斯诺登在美国的女友结束四个多月的沉寂，先后发出了多张照片并配有文字符号，分析人士猜测为密语，用来指示了斯诺登下一步行动。 　　

第五、在斯诺登在俄罗斯一年政治避难即将到期时，斯诺登接受了美国电视台的采访，不久后斯诺登律师宣布斯诺登又成功申请了三年的政治避难。可是斯诺登近期公开表明要与华盛顿协商回国，媒体又爆出斯诺登在俄疑似女友产子，两者时间高度重合。

为什么说斯诺登事件是一场骗局

这是一场最初针对中国，但被俄罗斯接手，将计就计玩坏了的骗局。

美国间谍斯诺登来到香港后，在英国卫报的配合假装“叛变”，揭露美国窃听全球的计划，企图获得中国信任获得政治避难。

如果计划一旦成功，斯诺登提供的大量伪造数据将对中国造成重大国际战略误判，同时美国也会给中国施加巨大的外交军事压力，如果斯诺登演的足够好还能成功打入中国国家安全系统，对中国国家安全进行深入破坏。

如果中国没有接纳斯诺登，斯诺登将会继续向世界各国发出避难申请，用以测试各国对美态度。

由于斯诺登这事来的太唐突，考虑到国际影响和各方态度，中国权衡再三下并没有同意斯诺登的入境。俄罗斯此时已洞若观火，基本确定了斯诺登的真实身份，对中国不接受斯诺登颇有微词，话外音大概是“美国想和你玩玩，你咋不陪他，要我我就玩死他。”中国顺水推舟把斯诺登这个烫手山芋扔给了俄罗斯。

斯诺登只好硬着头皮执行B计划，飞往俄罗斯，将所谓的秘密资料在飞往俄罗斯前交给了英国卫报记者，随后被销毁。

KGB出身的普京当然不会亏待斯诺登这个后辈。斯诺登提出政治避难申请，普京开出了停止爆料美国的条件。不得不说这一招很高，充分显示了俄罗斯对美国的“善意”和负责任大国的形象，而此时进退两难的斯诺登选择了撤回了俄罗斯的避难申请，转而向世界众多国家提交申请的办法。各国反应正如上文所见。

中国不接受斯诺登在计划的考虑范围内，在香港向全世界提出政治避难申请也是计划的一部分，不过中国顺水推舟推的太快，斯诺登还没来的及向世界发出申请就被送去俄罗斯。俄罗斯给斯诺登提供了优越的避难生活条件，将其软禁，还出于人道的考虑给他安排了一个性感女朋友。

事情并没有按照计划发展，身在俄罗斯遭到全面监控的斯诺登无法与上级联络，鉴于斯诺登已实际暴露的情况，美国被迫主动以斯诺登在美国女朋友的角色发布四组图片和符号，稳定斯诺登情绪，指示斯诺登下一步行动。

斯诺登开始了他第一年的软禁生活。就在斯诺登一年的政治避难即将到期之际，斯诺登接受了美国电视台的采访，这实际上是美国安全部门对斯诺登的更为直接的接触，苦等的一年斯诺登接到了原地待命、等候通知的指示。

人都会有弱点，斯诺登也是男人，尽管他也知道那位主动示好的性感女郎查普曼是俄罗斯间谍，不过为了演好戏，也为了满足自身需求，斯诺登还是选择了和查普曼在一起。但随着时间的推移，女特工查普曼的肚子越涨越大，斯诺登再也坐不住了，所以就有了近期愿意与华盛顿协商回国坐牢的表态。

斯诺登事件，由最初针对中国，并测试全球对美国忠诚度的骗局，在中俄联手下演变成了一场让美国出糗的闹剧。斯诺登在这场闹剧里越来越身不由己，不得不发表愿意回国的声明，向美国施压，争取早日解脱，而美国深知斯诺登目前不会有狗急跳墙，咬出美国幕后主使的可能，在极力避嫌撇清关系，对斯诺登的回国声明暂时没有反应。在大国博弈下，个人利益永远值得忽略。请让我们右嘴角保持三十度上扬，且看美国如何收拾斯诺登闹剧。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[-]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。图1-1本论文的技术路线?第二章基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析2.1引言河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30,hsp70,GABARAP,TPX1,和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。2.2材料和方法2.2.1河蚬的养殖河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录12.2.2miRNA的提取与测序首先使用天根miRcutemiRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化-nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。图2-1miRNA库建立与测序2.2.3miRNA测序数据生物信息学分析由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[,]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA:miRNA*对被认为是miRNA*。2.2.4miRNA的鉴定与表达分析为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5SrRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcutemiRNAFirst-strandcDNASynthesisKit(TianGen,China)试剂盒来提取，定量液使用miRcutemiRNAqPCRDetectionKit(SYBRGreen;TianGen,China)，定量仪使用AppliedBiosystemsReal-TimePCRSystem(LifeTechnology,USA)，定量引物使用miRprimer软件[]设计，见表2-1。表2-1河蚬miRNA定量使用的引物miRNA　　forwardprimer(5’→3’)reverseprimer(5’→3’)5srRNAaagttaagcaacgtcgagcccttagcccagttgttaccagcacf-miR-cagtgccatttttatcagtcacggtccagtttttttttttttttacagcf-miR-12cgcagtgagtattacatcaggtggtccagtttttttttttttttcagtcf-miR-acgcagtaatctcagctggt　　ggtccagtttttttttttttttcagaacf-miR-bcgcagtaatatcagctggtgtccagtttttttttttttttcaggacf-miR-67agcagacaacctgcttgaatgggtccagtttttttttttttttcctcf-miR-cagtggacggagaactga　　ccagtttttttttttttttgcccttcf-miR-10gcagtaccctgtagatccgaaggtccagtttttttttttttttacaacf-novel-14tggcactggcggaa　　ggtccagtttttttttttttttgtgacf-novel-2cagacactgcgatctattgaggtccagtttttttttttttttcttagtccf-novel-18tgccctatccgtcagtcgtccagtttttttttttttttgcagcf-novel-31gagctgcctgatgaagagtccagtttttttttttttttggaca2.2.5目的基因预测分析John等[]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi,hsp70,cyp4andmetallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda[]和RNAhybrid[]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。2.3结果与分析2.3.1miRNA序列分析我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,,条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表个序列的个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA,tRNA,snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的reads（代表16个不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。图2-1高质量reads长度分布表2-2河蚬中不同类型小RNAs长度分布SmallRNAUniqueRNAsPercent(%)　　TotalRNAsPercent(%)Total　　39,　　,,　　rRNA11,.,,.93tRNA　　2,　　5.,0.36snoRNA　　19　　0.　　0.00other　　10,.,.07miRNA16,　　40.,,　　80..3.2河蚬保守miRNAs确定为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[]。总共16个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过0测序数。miR-10测得1366个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-（），miR-（）和miR-7（322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。2.3.3河蚬新miRNAs的鉴定因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。图2-25个表达最高的新miRNAs预测二级结构2.3.4河蚬miRNAs的荧光定量为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2,Novel-14,Novel-18andNovel-31)和8个保守的(miR-10,miR-12,miR-67a,miR-,miR-a,miR-b,miR-andmiR-)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。图2-38个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平2.3.5河蚬miRNAs目的基因的预测为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-，miR-2b和Novel-40可能与调控河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。图2-4miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系表2-3miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi,hsp70,cyp4和metallothionein的关系Genes(geneID)miRandaRNAhybridConserved　　Novel　　ConservedNovelgst-pi(AY.1)　　miR-,miR-8a,miR-8bNovel-30,Novel-38miR-Novel-1*,Novel-4hsp70(KJ.1)miR-,miR-2a,miR-2b,miR-2cNovel-40　　miR-,miR-2b,miR-34,　　Novel-29,Novel-40cyp4(JQ.2)miR-10,miR-,miR-　　Novel-30,Novel-15,Novel-23,Novel-36　　miR-10,miR-,miR-,miR-,miR-a,miR-b,miR-34,miR-7　　Novel-1*,Novel-14,Novel-17,Novel-29,Novel-3,Novel-4metallothionein(EF.1)　　miR-,miR-,miR-7,　　miR-7,miR-Novel-20,Novel-29,Novel-31,Novel-6a,Novel-6b,Novel-82.4讨论我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1aandHoxB3a基因[]，DavidHassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox基因共表达，能调控Hox转录本的翻译[]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[]报道了牡蛎中miR-b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[]研究发现miR-的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。河蚬新miRNAs的表达量低，在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于0，绝大多数测序数小于[]。我们的结果与之前的研究是一致的[,]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。2.5本章小结在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。第三章河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆3.1引言目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。3.2材料与方法3.2.1实验材料3.2.1.1试剂TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT）18、DNaseI和dNTP购自Promega（USA）公司；bp和bpladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMARTRACEcDNAamplificationkit购自Clontech(USA）公司；TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit,pMD20-Tvector和E.coliJM感受态细胞购自TaKaRa(Dalian,China）公司；三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。3.2.1.2实验仪器CentrifugeR离心机(eppendorf,USA）PowePacBasic电泳仪(BIO-RAD,USA）GelDocXR+凝胶成像仪(BIO-RAD,USA）梯度热循环仪（Veritithermalcyclesystem）（LifeTechnologies，USA）MultiskanGO酶标仪（ThermoScientific，USA）荧光定量PCR仪Real-TimePCRsystem（LifeTechnologies，USA）3.2.1.3统计分析与绘图软件SPSS16.0软件，Origin8.0软件3.2.2河蚬的实验室养殖河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5mm左右的细沙，所用水为目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC，水质硬度在mg/L以下,光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。3.2.3RNA提取和cDNA合成3.2.3.1.RNA提取操作步骤：河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下：(1)取50-mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5mlEP管，迅速加入-μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的μLTrizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。(2)以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温放置3min，然后放入离心机，4℃，1转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。(3)每管加入uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。(4)1g，4°C，离心10min，弃上清，此时RNA沉于管底。(5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。(6)0g，4°C下离心5min，尽量弃上清。(7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA溶于无核酸水中。利用DNA的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD/OD.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。3.2.3.2.去除RNA中的DNA（1）用RNase-freeDNase去除样品中DNA污染。DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL）RNA　　16μLDNaseⅠ　　2μL10×DNaseⅠBuffer　　2μLTotalvolume20μL（2涡旋混匀后，37°C水浴30min。（3）加入RQ1DNaseStopSolution1μL，混匀，瞬时离心，65°C反应10min。（4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A/A大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。3.2.3.3.cDNA第一链的合成首先使用MultiskanGO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

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