个别中国大妈已成公害三分明月夜,二分归

人性的良知并不会因为一个人年龄的增长而增长…世态是～一个人如果没有与时俱进，那么年纪越大，人性会越龌龊。。。有些中年妇女在中国是一种自然灾害，这倒不是因为她们不好看，而是她们故意要恶心人！同时也在恶心自己。“可爱的中国大妈”，天下三分明月夜，无奈二分归大妈。中国人可能是真的有钱了！无论是国内还是国外，在那些比较著名的景区，到处都可以看到挤挤碰碰、吵吵嚷嚷的中国游客。不过你发现了吗，在这些中国游客中，男性少，女性大约占70%；在这些女性游客中，年轻女性少，五六十岁以上的中老年女性大约占70%；在这些中老年女性游客中，贤淑优雅型的淑女少，佻达庸俗型的悍女大约占70%。这类中老年悍女可能就是举世闻名的“中国大妈”？在载有多名游客的意大利赛琳娜游船上，到处都晃荡着中国大妈的靓丽身影。在甲板上，看来早有准备的中国大妈们扯出各种颜色鲜艳的丝巾，做出各式莫名其妙、颇令人呕心的姿态照相；在舞厅里，中国大妈们穿着色彩艳丽的丝绸旗袍，扭曲着肥硕的身躯，模仿服装模特的步伐，走过来、又走过去，自娱自乐；九楼的自助餐厅是游轮上最大的餐厅，至少有两千多游客在这里用餐。餐厅门口有个泳池，说是泳池，其实也就是个观鱼池罢了，因为长不过十米，宽不过五米，深不过一米，本来是给孩子们戏水玩的所在。因为气温较低，大人们根本不给孩子们下水。可就有几位勇敢的中国大妈，穿着紧身的锦纶泳衣，在上千人众目睽睽之下，在小观鱼池里落落大方地展示一身赘肉，不得不令人佩服。

赛琳娜游船在日本靠岸了，游客们登上日本国土，或兴奋或新奇地东张西望。看到码头广场飘扬着一面膏药旗，一位中国大妈突然昂声高唱起“五星红旗迎风飘扬”，接着又有几位大妈跟着高声唱起来，声音杂乱、尖锐而又刺耳。码头上几位日本警察和码头工人各忙各的，倒没有什么反映。跟大妈们走在一起的数千中国游客倒是有点吃惊和诧异。因为日本国旗插在日本国土上，这本是非常正常的事情，大妈们这么爱国，完全可以不来日本旅游，没有必要突然迸发出这么强烈的“爱国情愫”来的。

游轮上的自助餐厅虽然很大，毕竟游客太多，用餐时总是出现一座难求的情况。一张大餐桌围坐了七八个中国大妈，吃完了，再次捧来一大盘海瓜子（一种小蛤俐）。大妈们像嗑瓜子般，边嗑边唠。又捧来一盘水果，边啃边唱。全然不顾不少捧着餐盘找不到座位的其他旅客。一位大妈进了餐厅，那边高声尖叫“x姐，这儿给你占着位置呢！”x姐直冲过去，碰着一位捧着餐盘找位置的旅客，菜汤泼到衣服上了。X姐只是扭头咧了下嘴，也不知道这咧嘴算不算道歉，迳自走了，被碰撞了的旅客反倒显得尴尬。一位大妈，先是捧来一盘堆尖的水果，咕呲咕呲啃完了，又捧来一盘堆尖的牛肉、鸡肉、排骨，又咕呲咕呲啃完了，问题是，这些肉是和土豆、萝卜等蔬菜一起烧烩的，说明这位大妈在取菜时是做了精心挑选的。又一位大妈趴在餐桌上吃饭，旁边一个座位上则放着一个包，一位旅客捧着餐盘问道，这儿可以坐吗？大妈头也不抬地答道，有人呢！一会儿，大妈吃完了，一边抹嘴，一边自言自语道，她大概有座位了，走了。那位捧着餐盘的旅客也吃得差不多快完了，却是站也不是，坐也不是。在外旅游集体用餐，一般只管饱不管好，但每餐总会有两三个荤菜。一次旅游同行的几位大妈，往往转盘到她面前，不但把荤菜挑进自己碗里，还赶紧夹到旁边大概是老公的碗里，全然不顾周围还有其他游客。一次旅游不过几天时间，相遇是缘分，谁愿意为这点小事计较呢？

在一次江南一日游的大巴上，几位中国大妈上车并不抢前面的座位，反倒只向后走，这是很少见的，到最后两排，这几位大妈拉出准备好了的一个大旅行箱，打起扑克来。一日游，一般都是几次一两个小时的短途行程。大妈们每段行程都只是打扑克，到了景点或是购物点，既不游玩，也不购物，也只是一味找个地方打牌。上了车，导游总是要说点什么，有的游客就想闭眼打个瞌睡休息一下。可是大妈们打牌时旁若无人，吵吵喊喊，对谁都有妨碍。导游或游客大概都知道中国大妈不好惹，息事宁人，竟没人敢批评制止。

一日游结束时，每人收到一份赠礼：一盒八只大闸蟹，一箱饮料，一盒冰箱除味剂，据说是卖乳胶床垫的老板赠送的。这次旅游收费不过百十块，这几样赠品怎么也应当价值一百多块了呀？乳胶产品眼下很畅销，也很实用，每次或多或少都会有人买。估计利润不会小，所以老板愿意这么送，这个动作和旅行社一拍即合，所以这个旅游线路就成了一条热线。原来这几位大妈已经多次参加这条旅游线路了，反正在家也是打牌，而参加这条旅游线，吃喝玩乐，还能捞到超值的礼品，中国大妈真聪明。

一次在新疆旅游，由于新疆维稳抓得很紧，进任何公共场合都要严格安检。旅游期间，多是一天换一个宾馆。宾馆的安检就更严格，也就很费时间。一个三十多人的旅游团里，总会有七八个中国大妈。同时到宾馆的往往有几个旅行团，百十个人同时安检就更费时间了。可每次都有一两个大妈冲在前面，而这一两位大妈就是其他大妈的排队代表，不顾后面排了多少人，前面大妈一招手，后面七八个、十来个大妈就插到前面去，所以大妈们总是抢先消消停停近客房，别的旅客只能被挤在后面。赛琳娜游船在海上航行了五天五夜，终于停靠在上海吴淞口国际游轮码头了。船上多人，下船、过关、领行李，至少要排队两三个小时。加上还背着包，人太多，难免挤挤碰碰，对于年龄偏大、腿脚不利索的人来说，确实不易。好在船上可以花钱买贵宾通行证，可以优先下船过关。在贵宾通行舱口，一位中国大妈高举着贵宾通行证，嚷嚷道：让一让！让一让！这是贵宾通行道！说句老实话，站在这儿的，都持有贵宾通行证，该谁让谁呀？所谓贵宾只有两三百人，并不多，很轻松就可以下船了。再说，既然是贵宾了，也得像个贵宾的样子嘛，叫什么叫？毕竟是中国大妈，竟然拍拍前面人的肩膀，高声叫嚷：让一让！让一让！这是贵宾通行道！前面这位“贵宾”被叫得没办法，只好亮出贵宾通行证给这位大妈看，大妈不吱声了。也难怪，前面这位贵宾穿了一身普通的旧衣服，斜跨着一个黄背包，实在不像个贵宾。而后面这位大妈，衣着鲜亮，趾高气昂，也太把自己当个贵宾了。当然，这些现象中，也有其他各色人种。不过中国大妈总是主角、主体，这是不争的事实。不少知书达理、温文尔雅的老年妇女确实也挺令人尊重，但可惜被那些在世界上都有了些名气的“中国大妈”淹没了。中国大媽世界奇葩，林徽因，杨绛等一代高贵，优雅，端庄的民国范儿逝去，一个时代结来了，当年的头上长角，身上长刺，满口不革命就滚你妈的蛋的女红卫兵而今成了闻名世界的中国大妈，粗鄙，横蛮，无知，贪婪，而不和羞恥。当然，这只是一部份人，但几十年的阶级斗争，造成了中国人文主义被破环，传统的礼义廉取大滑坡，产生了这些具有中国特色的大媽们。

中国大妈成为“世界焦点”

根据百度百科：“中国大妈”是网络上引用美国媒体调侃国内中年女性大量收购黄金引起世界金价变动而来的一个新兴名词。《华尔街日报》甚至专创英文单词“dama”来形容“中国大妈”。解释是：中老年女性，大多数偏胖，精神饱满，声音大：走路成堆，排队加塞；较富余，喜购物，装束臃肿，热衷拍照，喜欢佩戴鲜艳丝巾。“中国大妈”对黄金的购买力导致国际金价创下年内最大单日涨幅。

慢慢地，“人傻钱多”的形象也越来越多的扣在中国大妈的身上。

“她们不差钱，啥贵买啥，这帮人最容易消（被）费（骗）”。

既然那么有钱，经常出门出国游玩自然也是少不了，不夸张的讲，中国大妈所到之处，都是一道“靓丽的风景线”。因为她们的特色太明显了，尤其是一堆人站在一起的时候，也是超级醒目。

大太阳帽、墨镜、丝巾、自拍杆、独特的时尚品味，都已然成为她们的标配。

无论是在中国还是其他地方...凡是旅游景点，总是能遇到一群说各地方言的穿着鲜艳的大妈经过。

中国大妈有权利选择自己做事的方式，但有些方式也实在是太辣眼睛了。如：

这位大妈在赏花时，一边踹树制造樱花雨又一边爬上树拍照，路人看的也是一脸尴尬。

据韩国媒体《东亚日报》报道，在首尔市光化门附近一家高级饭店的洗手间：男厕所里居然站着7名四五十岁的中国女游客。她们不仅洗手、照镜子，甚至有人使用卫生间。

旁观者林某说，这些女游客“理所当然”的态度让他感觉十分荒唐。

如今，中国大妈“低素质”行为屡见澳洲报端，她们的“奇葩行为”也是一次次超越了大家的想象。

吃霸王餐又咬人的中国大妈

在此强调，“贪小便宜”不等于“勤俭节约”。除了上述的故意扒菜叶，前不久澳洲也被曝光了一位“爱吃霸王餐”的中国大妈，吃饭不给钱还乱咬人。

这位大妈和老公去阿德莱德唐人街的一家中餐馆吃饭，点了一份烤鱼，但觉得烤鱼太大，就要求点“半份”。可是服务员表示店里不卖半条鱼，只卖整条鱼。

后来见她没什么意见，服务员就给她下单上了整条烤鱼。吃了一半，大妈挖空了肉，剩下鱼骨头和头时，叫来了服务员说：我说我只要半条鱼，是你要给我上整条的。所以，我只付半条鱼的钱。

不知所措的服务员当然是拒绝。大妈趾高气扬地表示要找警察，但在警察还没来的时候，大妈竟然准备起身走人，店长阻拦无效且被吃饱饭的大妈一把推开，顺便扔了26刀在店长脸上，然后就跑了。

店员赶忙出门去追，明知理亏却理不饶人的大妈情急之下抓过店员的手臂，张嘴就咬。大妈还发挥了女人打架的两项绝技——抓和挠，把小伙子的手上和耳朵弄得伤痕累累，到处是血。

想问下这位“擒贼”身手了得的“半条鱼大妈”，是谁给你的勇气？

最后在面对警方的指控，大妈振振有词地表示她的行为是“出于自卫”。PS：那干嘛要遮脸呢？

悉尼占道采花又拍照的亚洲大妈

中国大妈们退休的时候，出门旅游看看世界也是很棒的选择，无论是家人还是路人都没有任何异议。

但如果是这样的出行，别说是外国人，中国人见了也会嫌丢人躲着走。

蓝花楹盛开的季节，街上围观了大量的中国游客，她们嬉笑打闹，肆意占道...

澳洲虽然崇尚“车辆让行人”的精神，但人不让车又奈何...

诶，看花就看花，采花还大大咧咧拍照...她们是笑的很开心，凡是知道爱护环境的人看了都会扎心吧。

澳洲大妈看了这一幕也会表示：服气！

只在意自己的拍照，不顾其他在场游客心情，也不管其他车辆的正常运行，可以说是很自私了。

大妈在别人家门口偷植物

通过监控来看，这位大妈原本推着婴儿车从墨尔本一户人家慢慢走过，并无异常，殊不知她已经盯上人家门口的一颗植物。

没过多久，她竟然拿了一个塑料袋回来。

丝毫不犹豫的连根拔起，把坑填好，然后就放佛什么都没有发生过，拿着“赃物”就走了。

这一幕也是被监控系统拍了下来，不知道这位大妈看后会作何感想。

人在做，天在看。为了这点小便宜，整个社区的人也是都认识她了。

综上，包括“帮子女占车位”、“我不懂英语我有理”、“买东西把烂叶子全部扒掉”...这些常见的“大妈占便宜现”象在澳洲也是会发生的。

部分中国大妈之所以会有这种爱贪便宜、自私自利、不顾他人感受的心理，绝非是短时间形成的陋习，很可能是一开始就存在的，只是慢慢暴露出来，无论在哪，这种“劣根性”一直都存在。

甚至有些大妈为了能更好的融入集体，也组团跟风一些“低素质”的行为，一方面她们不想被孤立，另一方面她们觉得别人都可以那么做，自己也可以。何况在人生地不熟的海外，更没人认识自己。

尤其是涉及到子女利益，她们也是更“奋不顾身”，谁都不能欺负自家孩子...这种保护和爱护实则并没到积极的作用，反而让人觉得无比尴尬。

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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[-]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。图1-1本论文的技术路线?第二章基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析2.1引言河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30,hsp70,GABARAP,TPX1,和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。2.2材料和方法2.2.1河蚬的养殖河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录12.2.2miRNA的提取与测序首先使用天根miRcutemiRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化-nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。图2-1miRNA库建立与测序2.2.3miRNA测序数据生物信息学分析由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[,]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA:miRNA*对被认为是miRNA*。2.2.4miRNA的鉴定与表达分析为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5SrRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcutemiRNAFirst-strandcDNASynthesisKit(TianGen,China)试剂盒来提取，定量液使用miRcutemiRNAqPCRDetectionKit(SYBRGreen;TianGen,China)，定量仪使用AppliedBiosystemsReal-TimePCRSystem(LifeTechnology,USA)，定量引物使用miRprimer软件[]设计，见表2-1。表2-1河蚬miRNA定量使用的引物miRNA　　forwardprimer(5’→3’)reverseprimer(5’→3’)5srRNAaagttaagcaacgtcgagcccttagcccagttgttaccagcacf-miR-cagtgccatttttatcagtcacggtccagtttttttttttttttacagcf-miR-12cgcagtgagtattacatcaggtggtccagtttttttttttttttcagtcf-miR-a　　cgcagtaatctcagctggt　　ggtccagtttttttttttttttcagaacf-miR-bcgcagtaatatcagctggtgtccagtttttttttttttttcaggacf-miR-67a　　gcagacaacctgcttgaatgggtccagtttttttttttttttcctcf-miR-cagtggacggagaactga　　ccagtttttttttttttttgcccttcf-miR-10gcagtaccctgtagatccgaaggtccagtttttttttttttttacaacf-novel-14tggcactggcggaa　　ggtccagtttttttttttttttgtgacf-novel-2cagacactgcgatctattgag　　gtccagtttttttttttttttcttagtccf-novel-18tgccctatccgtcagtcgtccagtttttttttttttttgcagcf-novel-31　　gagctgcctgatgaagag　　tccagtttttttttttttttggaca2.2.5目的基因预测分析John等[]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi,hsp70,cyp4andmetallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda[]和RNAhybrid[]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。2.3结果与分析2.3.1miRNA序列分析我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,,条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表个序列的个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA,tRNA,snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的reads（代表16个不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。图2-1高质量reads长度分布表2-2河蚬中不同类型小RNAs长度分布SmallRNA　　UniqueRNAsPercent(%)　　TotalRNAs　　Percent(%)Total　　39,　　　　6,,　　rRNA11,.,,　　16.93tRNA　　2,　　5.,　　0.36snoRNA　　19　　0.　　0.00other　　10,　　25.,.07miRNA16,　　40.,,　　80..3.2河蚬保守miRNAs确定为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[]。总共16个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过0测序数。miR-10测得1366个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-（），miR-（）和miR-7（322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。2.3.3河蚬新miRNAs的鉴定因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。图2-25个表达最高的新miRNAs预测二级结构2.3.4河蚬miRNAs的荧光定量为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2,Novel-14,Novel-18andNovel-31)和8个保守的(miR-10,miR-12,miR-67a,miR-,miR-a,miR-b,miR-andmiR-)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。图2-38个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平2.3.5河蚬miRNAs目的基因的预测为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-，miR-2b和Novel-40可能与调控河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。图2-4miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系表2-3miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi,hsp70,cyp4和metallothionein的关系Genes(geneID)miRandaRNAhybridConserved　　Novel　　ConservedNovelgst-pi(AY.1)　　miR-,miR-8a,miR-8bNovel-30,Novel-38miR-　　Novel-1*,Novel-4hsp70(KJ.1)miR-,miR-2a,miR-2b,miR-2c　　Novel-40　　miR-,miR-2b,miR-34,　　Novel-29,Novel-40cyp4(JQ.2)miR-10,miR-,miR-　　Novel-30,Novel-15,Novel-23,Novel-36　　miR-10,miR-,miR-,miR-,miR-a,miR-b,miR-34,miR-7　　Novel-1*,Novel-14,Novel-17,Novel-29,Novel-3,Novel-4metallothionein(EF.1)　　miR-,miR-,miR-7,　　miR-7,miR-Novel-20,Novel-29,Novel-31,Novel-6a,Novel-6b,Novel-82.4讨论我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1aandHoxB3a基因[]，DavidHassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox基因共表达，能调控Hox转录本的翻译[]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[]报道了牡蛎中miR-b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[]研究发现miR-的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。河蚬新miRNAs的表达量低，在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于0，绝大多数测序数小于[]。我们的结果与之前的研究是一致的[,]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。2.5本章小结在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。第三章河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆3.1引言目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。3.2材料与方法3.2.1实验材料3.2.1.1试剂TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT）18、DNaseI和dNTP购自Promega（USA）公司；bp和bpladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMARTRACEcDNAamplificationkit购自Clontech(USA）公司；TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit,pMD20-Tvector和E.coliJM感受态细胞购自TaKaRa(Dalian,China）公司；三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。3.2.1.2实验仪器CentrifugeR离心机(eppendorf,USA）PowePacBasic电泳仪(BIO-RAD,USA）GelDocXR+凝胶成像仪(BIO-RAD,USA）梯度热循环仪（Veritithermalcyclesystem）（LifeTechnologies，USA）MultiskanGO酶标仪（ThermoScientific，USA）荧光定量PCR仪Real-TimePCRsystem（LifeTechnologies，USA）3.2.1.3统计分析与绘图软件SPSS16.0软件，Origin8.0软件3.2.2河蚬的实验室养殖河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5mm左右的细沙，所用水为目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC，水质硬度在mg/L以下,光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。3.2.3RNA提取和cDNA合成3.2.3.1.RNA提取操作步骤：河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下：(1)取50-mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5mlEP管，迅速加入-μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的μLTrizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。(2)以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温放置3min，然后放入离心机，4℃，1转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。(3)每管加入uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。(4)1g，4°C，离心10min，弃上清，此时RNA沉于管底。(5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。(6)0g，4°C下离心5min，尽量弃上清。(7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA溶于无核酸水中。利用DNA的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD/OD.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。3.2.3.2.去除RNA中的DNA（1）用RNase-freeDNase去除样品中DNA污染。DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL）RNA　　16μLDNaseⅠ　　2μL10×DNaseⅠBuffer　　2μLTotalvolume20μL（2涡旋混匀后，37°C水浴30min。（3）加入RQ1DNaseStopSolution1μL，混匀，瞬时离心，65°C反应10min。（4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A/A大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。3.2.3.3.cDNA第一链的合成首先使用MultiskanGO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega

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